گیندولینا تی ام

11.02.2022

لومینسانس - درخشش اتم ها، یون ها، مولکول ها، ناشی از انتقال الکترونیکی در این ذرات هنگام بازگشت از حالت برانگیخته به حالت عادی. بنابراین، مولکول انرژی جذب شده را به تابش خود تبدیل می کند (V. L. Levshin) لومینسانس را درخشش سرد می گویند.

طبقه بندی انواع لومینسانس 1. با توجه به مدت درخشش 2. بر اساس روش تحریک 3. با توجه به مکانیسم لومینسانس: درخشش مراکز گسسته - همان ذرات (اتم ها، مولکول ها، یون ها) جذب کننده هستند. و مراکز انتشار؛ درخشش نوترکیبی - فرآیندهای جذب و انتشار در زمان و مکان از هم جدا می شوند. در فرآیند تحریک، یک ذره از ماده به دو قسمت با بار مخالف تقسیم می شود. نوترکیب بعدی آنها با آزاد شدن انرژی A + hv A + + e A + + e A * A * A + hv 3 همراه است.

طبقه بندی لومینسانس بر اساس مدت زمان فلورسانس درخشش (~10-8 ثانیه) در طول فلورسانس، مولکول از حالت برانگیختگی کوتاه مدت به حالت پایه می رود و بلافاصله پس از جذب نور مشاهده می شود، به سرعت کاهش می یابد و به عنوان یک ناپدید می شود. نتیجه برخورد مولکول ساطع کننده با مولکول های دیگر در محلول (کوئنچ فلورسانس) فسفرسانس (> 10-6 ثانیه) فسفرسانس زمانی مشاهده می شود که یک مولکول از حالت برانگیخته نسبتا طولانی به حالت پایه می رود، به طوری که یک زمان نسبتا طولانی می تواند بین جذب و انتشار نور سپری شود. فسفرسانس با طول موج انتشار بیشتر، شدت کمتر و تأثیر بیشتر ماتریس 4 مشخص می شود. 10 -6 s) فسفرسانس در هنگام انتقال یک مولکول به حالت پایه از یک حالت برانگیخته نسبتا طولانی مدت مشاهده می شود، به طوری که زمان نسبتاً طولانی بین جذب و گسیل نور می گذرد. فسفرسانس با طول موج انتشار زیاد مشخص می شود. ، شدت کمتر و تأثیر بیشتر ماتریس

طبقه‌بندی لومینسانس با روش‌های برانگیختگی تابش الکترومغناطیسی در محدوده UV و مرئی Photoluminescence شار الکترون سه‌گانه (اشعه کاتدی) شار یونی فلز قلیایی

در عمل تحلیلی، نورتابی نوری و شیمیایی بیشتر استفاده می‌شود. اندازه‌گیری‌های فلورسنت انتخابی‌تر از اندازه‌گیری‌های اسپکتروفتومتری هستند، زیرا به دو طول موج بستگی دارند: نور جذب‌شده و ساطع شده. در مقایسه با طیف‌سنجی جذبی مولکولی، این روش از حساسیت بالاتری برخوردار است. این به دلیل آن است. با توجه به اینکه این روش یک روش نیرو است که در آن سیگنال خروجی با افزایش شدت تابش افزایش می‌یابد. محدودیت‌های تشخیص برای اکثر ترکیبات ~ میکروگرم بر میلی‌لیتر است که 1-2 مرتبه قدر کمتر از طیف‌سنجی جذبی 6 است.

علاوه بر این، در برخی موارد، طیف گسترده ای از محتویات تعیین شده مشاهده می شود - گاهی اوقات تا 4 مرتبه غلظت - با همان تکرارپذیری نتایج تجزیه و تحلیل مانند طیف سنجی جذب مولکولی. تجزیه و تحلیل 7

طیف‌سنجی لومینسانس مولکولی (فلورسنجی) فرآیندهای عکس در مولکول‌ها تحریک الکترونیکی یک مولکول با انتقال یک الکترون از حالت پایه به یک الکترون برانگیخته با انرژی بالاتر همراه است. با این حال، انتقال سریع همه حالت‌های برانگیخته به حالت پایه سیستم وجود دارد.

فرآیند تحریک الکترون های ظرفیت یک مولکول را در نظر بگیرید هر سطح الکترونیکی یا حالت انرژی (خطوط پررنگ در نمودار) توسط سطوح فرعی ارتعاشی با اعداد کوانتومی 0،1،2،3 و غیره (خطوط نازک) روی هم قرار می گیرند. کوانتوم نور جذب می شود، یک الکترون از سطح زمین به سطح بالاتر می رود. حالت برانگیخته منفرد وجود دارد (همه اسپین های الکترون ضد موازی هستند، الکترون های جفت نشده وجود ندارد) و سه گانه (اسپین های موازی) حالت پایه نمی تواند سه گانه باشد (طبق اصل پائولی، دو الکترون نمی توانند مجموعه کاملی از اعداد کوانتومی یکسان داشته باشند) 10

مکانیسم‌های بازگشت یک مولکول از حالت برانگیخته به حالت پایه انرژی اضافی مولکول‌های برانگیخته می‌تواند به دلیل تعدادی از فرآیندها از بین برود همه این فرآیندها با یکدیگر رقابت می‌کنند و سهم هر یک از آنها در اتلاف انرژی کل بستگی دارد. نسبت سرعت آنها اجازه دهید به نمودار یابلونسکی 11 برگردیم

در دمای اتاق، مولکول‌ها معمولاً در حالت پایه S 0 هستند و تقریباً تمام انتقال‌ها با جذب نور از سطح فرعی ارتعاشی پایین (زمین) به سطوح فرعی ارتعاشی حالت منفرد برانگیخته S 1 یا S 2 طول عمر یک الکترون رخ می‌دهد. در حالت منفرد برانگیخته است انتقال تابشی مولکول برانگیخته می شود، به دلیل به اصطلاح آرامش ارتعاشی در هنگام برخورد با مولکول های اطراف، خیلی سریع، در زمانی کمتر از ثانیه، انرژی ارتعاشی اضافی را از دست می دهد و به سطح ارتعاش زمین می رسد. حالت تک تک برانگیخته (انتقال با فلش های مواج نشان داده شده است) 13

فرآیند تبدیل داخلی در حالت‌های برانگیخته الکترونیکی بالاتر به همان سرعت است. این یک انتقال غیر تشعشعی بین سطوح ارتعاشی حالت‌های الکترونیکی مختلف است که انرژی یکسانی دارند (خط موجی افقی) تبدیل داخلی در حالت‌های الکترونیکی پایین‌تر S 1 S 0 کندتر است. فرآیند، می تواند با انتقال تابشی S 1 S 0 رقابت کند.

انرژی فوتون ساطع شده کمتر از انرژی فوتون جذب شده است، بنابراین طیف فلورسانس مولکول در منطقه با طول موج های طولانی تر در مقایسه با طیف جذب قرار دارد - قانون استوکس-لومل h lum

به یاد بیاورید که علاوه بر حالت منفرد، حالت برانگیخته سه گانه (اسپین الکترون موازی) امکان پذیر است. انتقال مستقیم از حالت پایه به حالت سه گانه برانگیخته در نتیجه جذب فوتون عملاً غیرممکن است. یک مولکول می تواند در نهایت به حالت سه گانه فقط در نتیجه انتقال از حالت های منفرد برانگیخته - تبدیل ترکیبی - انتقال غیر تشعشعی، که با یک فلش موجی نشان داده شده است) طول عمر یک الکترون در حالت سه گانه برانگیخته حداقل s است در حالت سه گانه، درست مانند حالت منفرد. حالت، آرامش ارتعاشی رخ می دهد، و الکترون به سطح ارتعاشی پایین تر T 1 20 عبور می کند.

غیرفعال‌سازی تابشی T 1 S 0 با انتقال تابشی T 1 S 0 رقابت می‌کند. برهمکنش اسپین-مدار، مرتبط با حرکت هسته ها است، بنابراین، با افزایش جرم هسته، برهمکنش اسپین-مدار به شدت افزایش می یابد (~ Z 4) بنابراین، بازده فسفرسانس زمانی که اتم هایی با اعداد اتمی بزرگ دارند افزایش می یابد. به عنوان مثال، ید یا برم، به مولکول فسفر (یا حلال) وارد می شود - اثر اتم سنگین 21

زمان تابش فسفرسانس s است، بنابراین، مولکول های سه گانه می توانند به راحتی انرژی خود را در فرآیندهای غیر تابشی مختلف از دست بدهند. در محلول ها، این اتفاق زمانی رخ می دهد که با مولکول های اکسیژن که دارای الکترون های جفت نشده هستند، برخورد کنند.

با مشارکت حالت T 1، فرآیند تابشی دیگری می توان انجام داد - فلورسانس تاخیری، که در نتیجه فعال شدن حرارتی مولکول های T 1 S 1 و انتشار بعدی از آن رخ می دهد. شرایط برای تجلی فلورسانس تاخیری عبارتند از کاملا خاص این نوع لومینسانس مولکولی در محدوده‌های بسیار محدودی از دما، ویسکوزیته و غلظت محلول‌ها مشاهده می‌شود و در مقایسه با فلورسانس و فسفرسانس، شدت آن کم است (چند درصد از شدت فلورسانس) و در اتاق و بالاتر به حداکثر مقادیر می‌رسد. دماها، به طور قابل توجهی با کاهش دما ضعیف می شوند. طیف فلورسانس تاخیری با طیف فلورسانس سریع منطبق است، اما طول عمر فلورسانس تاخیری برابر با طول عمر فسفرسانس 25 است.

ویژگی های مولکول های شب تاب طیف تحریک لومینسانس - وابستگی شدت لومینسانس I به فرکانس (تعداد موج) یا طول موج نور هیجان انگیز طیف لومینسانس - وابستگی شدت لومینسانس به طول موج آن I = f(λ); I \u003d f (v) طول عمر لومینسانس - زمانی که در طی آن شدت تابش با ضریب e کاهش می یابد، زیرا فروپاشی لومینسانس طبق قانون رخ می دهد: I t \u003d I 0 e -t / τ 27

اشعه ماوراء بنفش برای برانگیختن لومینسانس استفاده می شود. منابع تشعشع - لامپ های تخلیه گاز، اغلب جیوه - کوارتز و زنون اندازه گیری تشعشعات شب تاب اغلب در زوایای قائم با پرتو نور فرودی انجام می شود، بنابراین کووت ها باید در همه جهات شفاف باشند دستگاه با کیفیت بالا دارای 2 تک رنگ - برای ثبت طیف تحریک و فلورسانس در خدمت چشم انسان است. ابزارهای مدرن از مولتی‌پلی‌کننده‌های نوری استفاده می‌کنند برای تشخیص فسفرسنس، به دستگاهی برای خنک کردن نمونه نیاز است و می‌توان از یک قطع کننده مکانیکی یا الکترونیکی برای تابش پالس‌های کوتاه به نمونه استفاده کرد و در نتیجه فسفرسانس بلندمدت را از فلورسانس کوتاه‌مدت جدا کرد.

شرکت پکتروفلوئوریمتر سی هوریبا فلوروماکس

تجزیه و تحلیل کمی بر اساس وابستگی شدت لومینسانس به غلظت ماده شب تاب نور 34 است.

10 -4 M خطی بودن نمودار به دلیل کاهش غلظت لومینسانس، خودجذب و غیره شکسته شده است. غلظت (10-7-10-4 M) در غلظت های >10-4 M خطی بودن نمودار به دلیل کاهش غلظت لومینسانس، خودجذب و غیره شکسته می شود. وابستگی شدت فلورسانس" class="link_thumb"> 35 !}وابستگی خطی در محدوده 3-4 مرتبه غلظت (M) است. در غلظت های >10-4 M، خطی بودن نمودار به دلیل کاهش غلظت لومینسانس، خود جذبی و غیره نقض می شود. وابستگی شدت فلورسانس به غلظت یک ماده فلورسنت 35 10 -4 M خطی بودن نمودار به دلیل کاهش غلظت لومینسانس، خودجذب و غیره شکسته شده است. درخشندگی، خود جذبی، و غیره. وابستگی شدت فلورسانس به غلظت ماده فلورسنت 35" > 10 -4 M خطی بودن نمودار به دلیل کاهش غلظت لومینسانس، خودجذب و غیره شکسته می شود. وابستگی شدت فلورسانس "title="(!LANG: وابستگی خطی در 3-4 مرتبه بزرگی غلظت (10 -7 -10 -4 M) در غلظت های >10 -4 M، خطی بودن نمودار است. به دلیل کاهش غلظت لومینسانس، خودجذب و غیره نقض می شود. وابستگی شدت فلورسانس"> title="وابستگی خطی در 3-4 مرتبه غلظت (10-7-10-4 M) است. در غلظت های >10-4 M خطی بودن نمودار به دلیل کاهش غلظت لومینسانس، خودجذب و غیره نقض می شود. وابستگی شدت فلورسانس"> !}

خاموش شدن لومینسانس زمانی اتفاق می‌افتد که یک مولکول برانگیخته با مولکول‌های دیگر، به‌ویژه مولکول‌های پارامغناطیس (اکسیژن محلول)، که فرآیندهای تبدیل ترکیبی را تحریک می‌کنند، برخورد می‌کند. افزایش دما باعث کاهش بازده لومینسانس می‌شود. این به دلیل این واقعیت است که فرکانس برخوردها افزایش می یابد، که در آن غیرفعال کردن غیر تشعشعی مولکول های برانگیخته رخ می دهد. بنابراین، تعیین معمولا در دمای اتاق انجام می شود.وجود مواد خارجی نیز باعث کاهش بازده لومینسانس می شود. فعال ترین خاموش کننده های لومینسانس کاتیون ها و آنیون های عناصر "سنگین" (I -، Br -، Cs +، و غیره)، یون ها و مولکول های پارامغناطیس (Mn 2 +، O 2، و غیره)، مولکول های حلال خود جذب - شامل جذب بخشی از نور ساطع شده توسط لایه ای از ماده درخشان 36

کاربرد روش 37 تعداد مواد فلورسنت محدود است. این روش برای تعیین مواد با لومینسانس ذاتی (ترکیبات U(VI)، به ویژه یون های فلزی اورانیل - UO 2 + یون، REE و غیره) به شکل کمپلکس هایی با معرف های آلی: 8-هیدروکسی کینولین و مشتقات آن ( بیش از 25 عنصر شامل Li، Ca، Mg، Ba، Sc، Al، In، Ga) ترکیبات اکسیازو و اکسیازومتین (Al، Ga، Mg و غیره) پلی اکسی فلاون ها (Zr، Hf، Sn، Th، Al، ب) رنگ های رودامین (Au، In، Ga، Hg، B، Te، و غیره) مواد آلی - سیستم های پلی آروماتیک متراکم (آنتراسن، فلورن، فلورسین)

38 فسفر کریستال یا محلول جامد. معمولاً آنها با تف جوشی ماده پایه (ZnS، CdS، CaS، SrS، و غیره) با یک فعال کننده (ترکیبات Ag، Cu، منگنز، Ce، و غیره) و شار (NaCl، NaNO 3، K C l، CaF 2 و غیره). در برخی موارد، فسفر کریستال را می توان با کریستالیزاسیون همزمان فعال کننده و ماده پایه از محلول اشباع دومی به دست آورد. طیف لومینسانس فسفر کریستالی بر اساس نوع فعال کننده تعیین می شود.فسفر کریستالی با نمادهای شیمیایی ماده اصلی که ساختار کریستالی فعال کننده و شار را تشکیل می دهد مشخص می شود. به عنوان مثال، علامت ZnS × Ag × NaCl به این معنی است که این فسفر کریستالی سولفید روی است که توسط اتم های نقره فعال می شود و در سنتز آن از مذاب کلرید سدیم استفاده شده است.

به عنوان مثال، اورانیوم در مقدار 10-5 میکروگرم را می توان با استفاده از فسفر کریستال بر اساس NaF، آنتیموان به مقدار 10-6 میکروگرم، بر اساس CaO، عناصر خاکی کمیاب به مقدار 10-6 میکروگرم، بر اساس تعیین کرد. ThO 2. حساسیت تعیین قابل مقایسه است و گاهی اوقات حتی برتر از روش های اتمی - طیف سنجی است: انتخاب پذیری خیلی بالا نیست 39

تعیین ترکیبات آلی بر اساس الف) روش های مستقیم فلورسانس و فسفرسانس ب) اثر Shpolsky ج) فسفرسانس در دمای اتاق انجام می شود در این حالت، مولکول ها از یکدیگر جدا شده و به طور صلب در حلال ثابت می شوند که در نتیجه طیف ها مجموعه ای از خطوط طیفی باریک هستند و فردیت مشخص دارند 42

فسفرسانس مولکول های آلی به دلیل غیرفعال شدن حالت های سه گانه برانگیخته است. طول عمر حالت های سه گانه آنقدر طولانی است (تا 100 ثانیه) که برای مشاهده فسفرسانس، لازم است مولکول در حالت سه گانه در یک ماتریس صلب ثابت شود، یعنی بی حرکت شود. بیحرکتی احتمال غیرفعال سازی غیر تشعشعی مولکول های سه گانه را از طریق برخورد و تبدیل داخلی کاهش می دهد.برای به دست آوردن طیف فسفرسانس، حلال های آلی استفاده می شود که در دماهای پایین متبلور می شوند، اغلب از مخلوط ها استفاده می شود: اتیل الکل - دی متیل فرمامید. اتیل الکل - ایزوپنتان - دی اتیل اتر که در نقطه جوش نیتروژن مایع به صورت توده شیشه ای متبلور می شوند 77 K 44

45 برای اندازه گیری فسفرسانس در دمای اتاق، فسفر را روی یک جاذب تیمار شده با نمک های Ag، Tl، Hg، برومیدها، یدیدها و غیره ثابت می کنند (اثر اتم سنگین). خاص

تجزیه و تحلیل کیفی 46 طیف لومینسانس یک ویژگی فردی یک ماده شب تاب است. این طیف می تواند برای تجزیه و تحلیل کیفی لومینسانس استفاده شود. به طور معمول، چنین تحلیلی به صورت بصری با رنگ تابش انجام می شود. آنالیز کیفی شب تاب برای مطالعه مواد معدنی، تعیین درجه شیشه ها، درجه روغن های روان کننده و غیره استفاده می شود. واکنش های کیفی شب تاب که برای تشخیص یون ها استفاده می شود بسیار حساس است. ظاهر یا ناپدید شدن لومینسانس معمولاً به صورت بصری مشاهده می شود زمانی که معرف های آلی به محلول های آلی اضافه می شوند. نمکهای معدنی.بنابراین سبز روشن لومینسانس لیتیوم با 8-هیدروکسی کینولین در حضور 0.1 میکروگرم در میلی لیتر لی رخ می دهد، مس با لومینسانس آبی روشن ترکیب آن با سالیسیل آلازین در غلظت 0.05 میکروگرم در میلی لیتر و غیره کشف می شود.

تجزیه و تحلیل نورتابی شیمیایی 47 تابش نورتابی شیمیایی هنگامی مشاهده می شود که یک مولکول برانگیخته در جریان یک واکنش شیمیایی تشکیل می شود، که قادر است پس از انتقال به حالت پایه، درخشندگی داشته باشد. 160 کیلوژول بر مول برای تحریک نورتابی شیمیایی در ناحیه مرئی طیف مورد نیاز است. این برای واکنش‌های رادیکال، زنجیره‌ای و ردوکس که طبق مکانیسم رادیکال آزاد پیش می‌رود، معمول است.

48 در عمل، واکنش های اکسیداسیون تعدادی از مواد آلی، مانند لومینول (V)، لوفین (VI)، لوسیژنین (VII)، و غیره، اغلب مورد استفاده قرار می گیرند. مهار واکنش نورتابی شیمیایی تغییر در شدت متناسب با غلظت عناصر برای انجام تجزیه و تحلیل، تنها لازم است شدت تابش نورانی در حال ظهور با استفاده از یک ضرب‌کننده نوری اندازه‌گیری شود، از آنجایی که تنها منبع تابش یک واکنش شیمیایی است، تجزیه نور به یک طیف لازم نیست. یک تک رنگ یا منبع تابش مورد نیاز است

روش لومینسانس شیمیایی برای تعیین مواد معدنی و آلی با حد تشخیص حداکثر 10-8٪ استفاده می شود. روش‌هایی برای تعیین فلزات پلاتین، آهن، کبالت، نیکل، مس، کروم و غیره با LO تا میکروگرم در میلی‌لیتر ابداع شده است، اما این روش‌ها گزینش پذیری بالایی ندارند. روش‌های آنالیز گاز انتخابی بیشتر: تعیین ازن، نیتروژن اکسیدها و آمونیاک پس از تبدیل آنها به NO. واکنش های NO + O 2 NO 2 * + O 2 NO 2 * NO 2 + hv با لومینسانس با حداکثر در 800 نانومتر همراه است. حساسیت تعیین ازن با رنگ رودامین B تا % (1ppb) است.

طیف سنجی اتمی - فلورسانس 50 روش تجزیه و تحلیل عنصری اتمی - فلورسانس با طیف فلورسانس اتمی نمونه تجزیه و تحلیل شده اتمیزه می شود، بخار اتمی حاصل با جریانی از نور تابش می شود تا فلورسانس را تحریک کند. فلورسانس ساطع شده توسط اتم های برانگیخته (معمولا رزونانس) ثبت می شود.اگر شار نور حاوی کوانتایی با انرژی متناظر با برانگیختگی سطح اول باشد، اتم تابیده شده به حالت برانگیخته می رود و پس از بازگشت، نوری با یک نور ساطع می کند. طول موج مربوط به انتقال تشدید. به این فرآیند فلورسانس تشدید کننده نیز می گویند.

51 شماتیک تحریک فلورسانس: فلورسانس رزونانس a و b از سطوح مختلف. رزونانس c و فلورسانس استوکس. d رزونانس و فلورسانس ضد استوکس. فلورسانس آبشاری; تحریک گام به گام فلورسانس توسط دو کوانتا (ν12 + ν23)

52 بسته به تعداد فوتون در هر رویداد تحریک، مکانیسم تحریک می تواند تک فوتون یا چند فوتونی گام به گام باشد. و ضد استوکس، زمانی که فوتون ساطع شده بیشتر از جذب شده باشد.اگر انتقال از حالت برانگیخته به حالت پایه با انتقال های پی در پی که هر کدام با گسیل فوتون همراه است انجام شود، این نوع فلورسانس است. فلورسانس آبشاری نامیده می شود (e) در اتم های واقعی، تعداد سطوح انرژی الکترونیکی بیش از سه است. برای پر کردن هر یک از آنها، تعدادی احتمال وجود دارد که شامل انتقال گام به گام و آبشاری در فرآیندهای برخوردی و تشعشعی است. لامپ های بدون الکترود فرکانس). به عنوان یک قاعده، تعداد خطوط در طیف فلورسانس اتمی از ده تجاوز نمی کند.

53 برای اتمیزه کردن نمونه های مایع (محلول)، می توان از هر روش اتمیزه کردن شعله، پلاسمای جفت شده القایی با فرکانس بالا یا اتمایزرهای الکتروترمال (لوله های گرافیت، رشته ها، میله ها، بوته های گرم شده با جریان الکتریکی) استفاده کرد. نمونه های پودری با الکتروترمال اتمیزه می شوند. روش در بوته ها یا کپسول های گرافیتی که گاهی اوقات نمونه هایی به شعله اضافه می شود تا بخارات بیشتر گرم شود.ترکیب شیمیایی شعله ها به گونه ای انتخاب می شود که بازده فلورسانس (یعنی نسبت انرژی جذب شده به عنوان فلورسانس) و درجه اتمیزاسیون به حداکثر می رسد برای جلوگیری از خاموش شدن فلورسانس، مقداری آرگون به شعله اضافه می شود و اتمایزر معمولاً برای افزایش بازده در یک اتمسفر آرگون قرار می گیرد.

55 برانگیختگی یک اتم تحت تأثیر یک منبع تشعشع خارجی رخ می‌دهد. کسر اتم‌های برانگیخته نه با دمای اتمی‌ساز، مانند یک نیروگاه هسته‌ای، بلکه با شدت این منبع برای اتم‌های آزاد، مقادیر تعیین می‌شود. بازده کوانتومی معمولاً به دلیل دمای بالای محیط بسیار کم است؛ تحریک فلورسانس با استفاده از لامپ‌های شدید با خط یا طیف پیوسته (لامپ‌های دارای کاتد توخالی یا بدون الکترود) و همچنین لیزرهایی با طول موج قابل تنظیم. اخیراً روش APS منحصراً در نسخه لیزری - LAFS توسعه یافته است.

56 لیزرها یا مولدهای کوانتومی نوری منابع مدرن تشعشعات منسجم هستند. اساس فیزیکی برای عملکرد لیزر، پدیده تابش القایی تحریک شده است. ماهیت این پدیده این است که یک اتم برانگیخته قادر به گسیل یک فوتون تحت عمل لیزر است. فوتون دیگری بدون جذب آن، اگر انرژی دومی برابر با اختلاف انرژی سطوح اتم تا و پس از تابش باشد، در این حالت، فوتون ساطع شده با فوتونی که باعث تشعشع شده است، منسجم است. "کپی دقیق")؛ درجه بسیار بالایی از تک رنگی بودن آن در تابش منابع غیر لیزری دست نیافتنی است در نتیجه تابش هماهنگ و مشترک کوانتوم های نور توسط بسیاری از اتم های ماده عامل، تقویت نور رخ می دهد. این پدیده با انتشار خود به خودی متفاوت است. فوتون های ساطع شده دارای جهت های تصادفی انتشار، قطبش و فاز هستند. در کسری از میلی وات تا -10 13 W (در حالت پالسی)

هلیوم - لیزر نئون 58 در تخلیه الکتریکی با ولتاژ بالا، در اثر برخورد با الکترون ها، بخش قابل توجهی از اتم های هلیوم به حالت برانگیخته می رود. در یک سطح پمپاژ به اندازه کافی بالا در مخلوطی از هلیوم و نئون، یک فرآیند بهمن مانند تولید مثل فوتون های منسجم یکسان آغاز می شود. اگر سلولی با مخلوطی از گازها بین آینه های بسیار بازتابنده قرار گیرد، تولید لیزر رخ می دهد. پرتو نورانی در مرکز خود پرتو لیزر نیست، بلکه یک تخلیه الکتریکی است که درخششی ایجاد می کند، مشابه آنچه در لامپ های نئونی اتفاق می افتد. پرتو به شکل یک نقطه قرمز درخشان بر روی صفحه نمایش سمت راست پخش می شود.

59 سیگنال تحلیلی تابش در قسمت UV طیف است که توسط اتم های برانگیخته ساطع می شود. شدت فلورسانس تشدید اتمی در تقریب اول با غلظت ذرات ساطع کننده متناسب است: I 0 شدت نور هیجان انگیز V kv است. بازده کوانتومی فلورسانس k ضریب جذب است l ضخامت لایه محلول

تداخل اصلی در تعیین فلورسانس اتمی عناصر، تابش پراکنده است، که به دلیل پراکندگی تابش از یک منبع تحریک بر روی اتم ها و مولکول های نمونه تجزیه و تحلیل شده ایجاد می شود. تابش پراکنده اغلب سیگنال های فلورسانس تشدید ضعیف را پوشش می دهد، طول موج خط تحلیلی را می پوشاند. همان طول موج نور پراکنده است از خطوط فلورسانس غیر رزونانسی برای اندازه گیری استفاده می شود تا از تداخل ناشی از تابش پراکنده جلوگیری شود در این حالت، اثر تحریک تنها با کمک لیزر به دست می آید.

61 برای ثبت طیف فلورسانس، از اسپکتروفتومترهای با دیافراگم بالا با زاویه زیاد استفاده کنید. شدت تابش منتشر شده در زوایای قائم نسبت به تابش هیجان انگیز را اندازه گیری کنید (در این جهت، شدت نور پراکنده معمولا حداقل است)

69 مشخصه خط طیف فلورسانس اتمی گزینش پذیری بالایی را برای تجزیه و تحلیل فلورسانس اتمی تضمین می کند.خطوط در طیف فلورسانس اتمی بسیار باریک هستند و این امکان تعیین چندین عنصر را به طور همزمان فراهم می کند. برای این کار تعداد مناسبی اسپکتروفتومتر با دیافراگم بالا در اطراف اتومایزر نصب می شود.روش AFS به راحتی خودکار می شود، هزینه تجهیزات نسبتاً پایین است. ادرار)، ترکیبات شیمیایی مختلف، برای تعیین از راه دور عناصر در جو فوقانی.

مقایسه حدود تشخیص عناصر (ng/mL) با روش های طیف سنجی اتمی ElementAAS (شعله) AAS (e/t)AES (شعله) AES (PPT) AES (ICP) APS Al Ba Be BV Bi W Gd Ga Ge Fe Au In سی دی K , 5 1 0.01 0.04 0.1 8 0.01 0.1 0.01 0.02 0.0002 0.01 2 0.5 0.3 0.2 0.01 0.003 0.1 0.003 0.1 0.8 0.01 0.02 0.02 0.002

مقایسه محدودیت‌های تشخیص عناصر (ng/mL) با روش‌های طیف‌سنجی اتمی ElementAAS (شعله) AAS (e/t)AES (شعله) AES (PPT) AES (ICP) APS Mg Mn Cu Mo As Na Ni Sn Hg Pb Se Ag SB U ZN 0.1 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.04 0.04 0.04 0.01 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.1 0 0.06 0.1 0 0.06 0.1 0،

E. O. Puchkov
دکترای علوم زیستی، موسسه بیوشیمی و فیزیولوژی میکروارگانیسم ها. G. K. Scriabin RAS
«شیمی و زندگی» شماره 9، 1393

دو مقاله در این شماره از "شیمی و زندگی" به طور همزمان در مورد درخشش اشیاء بیولوژیکی صحبت می کنند. در عکس سمت چپ - یک کرم موی کوچک فریدریشیا هلیوتا، توسط دانشمندان دانشگاه کراسنویارسک کشف شد. در مورد چگونگی مطالعه لوسیفرین او، ماده ای که با اکسید شدن توسط آنزیم لوسیفراز، نور آبی متمایل به ساطع می کند، در مقاله "چراغ های زیر پای شما" مطالعه شده است. در عکس سمت راست، fridericia luciferin مصنوعی در حضور ATP و سایر اجزای ضروری، همان درخشندگی عصاره پروتئین کرم را نشان می‌دهد. این تایید می کند که ساختار لوسیفرین به درستی ایجاد شده است.

بر خلاف میکروسکوپ های فلورسانس، فلوسیتومترها اجازه مشاهده اجسام فلورسنت را نمی دهند. نقطه قوت آنها سرعت ثبت سیگنال ها از اجسام منفرد، به عنوان مثال، از سلول های در حالت تعلیق است. یک سیتومتر معمولی در دسترس تجاری با سرعت 1000 سلول در ثانیه کار می کند و سیتومترهای تخصصی با کارایی بالا - تا 25000 سلول در ثانیه! در نسخه استاندارد، هر جسم از دو تا ده پارامتر اندازه گیری می شود: پراکندگی نور و فلورسانس یک یا چند فلوروفور. بنابراین، می توان نتایج آماری قابل توجهی در مورد ناهمگنی جمعیت های سلولی، به ویژه میکروبی به دست آورد. همچنین دستگاه‌هایی وجود دارند که می‌توانند سلول‌ها را بر اساس پارامترهای خاصی از پراکندگی نور یا فلورسانس مرتب کنند تا سپس با استفاده از روش‌های دیگر، زیرجمعیت‌ها را مطالعه کنند.

... و چه می توان از آنها آموخت

بنابراین، همه گزارشگران فلورسنت دارای تخصص هستند، یعنی می توانند به طور انتخابی ویژگی های خاصی از یک سیستم بیولوژیکی را مشخص کنند. اجازه دهید به اختصار به چند دسته از «متخصصان» بپردازیم.

با کمک تعدادی از گزارشگران فلورسنت (معمولاً فلوروفورهای آلی)، می توان کاتالیز آنزیمی را بررسی کرد - برای مطالعه پویایی واکنش های آنزیمی، محلی سازی آنها در سلول ها، بافت ها، اندام ها و غیره. اینها، به عنوان مثال، سوبستراهایی با فلوروفورهای متصل کووالانسی، که تنها پس از آزاد شدن در طی واکنش شروع به فلورسانس می کنند، یا "پروفلوئوروفورها" که هنگام برهم کنش با محصول واکنش، فلورسنت می شوند.

گزارشگرانی که بر اساس آنتی بادی ها تشکیل شده اند - مجتمع های فیزیکی یا ترکیبات کووالانسی فلوروفورها با آنتی بادی ها - در مورد روند واکنش های ایمونولوژیک اطلاع می دهند. جزء فلورسنت می تواند هر یک از فلوروفورهای آلی و معدنی شناخته شده، از جمله نقاط کوانتومی باشد. علاوه بر این، آنزیم ها را می توان به آنتی بادی ها متصل کرد تا واکنش ها را با تشکیل یک محصول فلورسنت کاتالیز کند. فن‌آوری‌های مدرن به دست آوردن آنتی‌بادی برای هر پروتئین (آنتی ژن) مورد علاقه محقق را ممکن می‌سازد، در حالی که یک آنتی‌بادی با برچسب فلورسنت باعث درخشش این پروتئین یا ساختار ساخته شده از آن می‌شود. برای مثال، با استفاده از آنتی‌بادی‌های فلورسنت، میکروفیبریل‌ها در فیبروبلاست‌های موش شناسایی شدند (عکس را در صفحه جلد دوم ببینید).

روش های استفاده از پروتئین های فلورسنت (FP) بسیار آموزنده هستند. قبلاً به سودمندی روش‌هایی برای معرفی ژن‌های پروتئین فیوژن به سلول اشاره کردیم که باعث فلورسانس پروتئین طبیعی یا حتی اسید نوکلئیک می‌شوند. علاوه بر این، فلورسانس پروتئین های هیبریدی حاوی FB به اسیدیته محیط بستگی دارد، که اندازه گیری pH را نه تنها در داخل سلول، بلکه در داخل اندامک های فردی نیز ممکن می سازد، اگر چنین پروتئینی به هسته یا "خطاب" شود. میتوکندری

استفاده از FBs در ترکیب با تکنیک‌های اندازه‌گیری فلورسانس مبتنی بر انتقال انرژی غیر تشعشعی مورد توجه خاص است. دو پروتئین هیبریدی را تصور کنید که یکی از آنها در هنگام نزدیک شدن باعث فلورسانس دیگری می شود. به طور مشابه، تغییرات ساختاری (ساختاری) در پروتئین ها را می توان با اتصال FBs به مناطق مختلف یک مولکول پروتئین مورد مطالعه قرار داد.

حساسیت فلورسانس به خواص فیزیکی ریزمحیط فلوروفورها امکان استفاده از برخی از آنها را به عنوان گزارشگر پارامترهای مختلف محیط درون سلولی فراهم می کند. در میان آنها، به عنوان مثال، ویسکوزیته سیتوپلاسم، محتویات داخلی اندامک ها، لایه آبگریز بیوممبران. برهم کنش برخی فلوروفورها با غشاهای بیولوژیکی به تفاوت پتانسیل های الکتریکی در سراسر غشا بستگی دارد: با کمک چنین گزارشگرانی، اطلاعاتی در مورد بزرگی پتانسیل غشا به دست می آید. حتی گزارشگرانی برای اندازه گیری دمای داخل سلولی وجود دارد!

نه فقط با چشم

امکانات تحلیل بصری عمدتاً با ارزیابی کیفی محدود می شود: "درخشش وجود دارد - هیچ درخششی وجود ندارد." اطلاعات بسیار بیشتری با ویژگی های کمی ارائه می شود (به فصل "زبان گزارشگران فلورسنت" مراجعه کنید).

دو روش برای تعیین کمیت فلورسانس استفاده می شود. اولین مورد برای اندازه‌گیری ویژگی‌های مختلف فلورسانس در یک ناحیه نسبتاً بزرگ (ماکروسکوپی) از جسم استفاده می‌شود که به دست آوردن ویژگی‌های متوسط برای جسم را تضمین می‌کند: محلول، تعلیق ذرات کلوئیدی، سلول‌ها، ذرات زیر سلولی و غیره. مورد دوم بر روی اجسام تک میکروسکوپی متمرکز است، در درجه اول سلول ها و ذرات زیر سلولی.

اندازه‌گیری‌های فلورسانس انتگرال با استفاده از اسپکتروفلورسنج (طیف‌فتومترهای فلورسانس) و فلورسنج صفحه (eng. بشقاب خوان). اسپکتروفلوئورومترها عموماً ابزارهای تحلیلی هستند که بر اساس آنها می توان تمام ویژگی های اساسی فلورسانس را به دست آورد. فلورومترهای صفحه ای دستگاه هایی برای آنالیز تعداد زیادی نمونه (گاهی بیش از هزار) هستند، اما فقط برای چند ویژگی ثابت، به عنوان مثال، شدت فلورسانس در یک ناحیه طیفی خاص و/یا طول عمر فلوروفور در حالت برانگیخته. اکثر تکنیک‌ها با استفاده از فلورمترهای صفحه‌ای بر اساس واکنش‌های ایمونولوژیک یا تجزیه و تحلیل رشد کشت‌های سلولی در تک لایه‌ها هستند.

روش اندازه گیری فلورسانس اجسام تک میکروسکوپی نیز دو گزینه دارد.

اولین مورد بر اساس به دست آوردن تصاویر دیجیتالی از اشیاء با تجزیه و تحلیل کامپیوتری بعدی است. مورد دوم بر اساس اندازه گیری "قطعه به قطعه" فلورسانس اجسام ریز در یک جریان، هنگام عبور از مویرگ باریک یک دستگاه خاص - یک فلوسیتومتر بود.

میکروسکوپ فلورسانس اخیراً یک انقلاب واقعی را تجربه کرده است: دستگاه‌های جدیدی توسعه یافته‌اند، عمدتاً میکروسکوپ‌های کانفوکال، که در آنها فلورسانس از طریق یک سوراخ میکروسکوپی برانگیخته شده و ثبت می‌شود که درخشش «اضافی» را که خارج از کانون هدف اتفاق می‌افتد را قطع می‌کند. این "مردمک" تصویر را در سطح افقی و/یا عمودی اسکن می کند، سیگنال ها توسط یک مولتی پلایر نوری ثبت می شوند و پس از پردازش کامپیوتری آنها، تصویر فضایی از جسم به دست می آید. این طراحی در مقایسه با میکروسکوپ های استاندارد، تصاویر دو بعدی و سه بعدی واضح تری تولید می کند. علاوه بر این، پارامترهای فروپاشی فلورسانس را می توان با استفاده از میکروسکوپ های کانفوکال مدرن اندازه گیری کرد.

به نظر می رسد نوع دیگری از عملکردهای میکروسکوپ "انقلابی" برخلاف اصول اولیه فیزیکی فلورسانس است. اتم های موجود در آنها توسط نوری با طول موج بلندتر از فلورسانس تحریک می شوند، نه کوتاهتر. در واقع هیچ قانون فیزیک در حین کار این میکروسکوپ ها نقض نمی شود، فقط با شدت کافی شار نور با طول موج بیشتر، دو فوتون می توانند به طور همزمان به یک اتم برخورد کنند، انرژی جذب شده توسط الکترون ها دو برابر می شود و می چرخد. برای تحریک فلورسانس کافی است. بنابراین به چنین میکروسکوپ هایی دو فوتونی می گویند. و از آنجایی که شار نور حداکثر در فوکوس لنز متمرکز است، شرایط برای تصاویر با وضوح بالا تضمین می شود. میکروسکوپ‌های دو فوتونی همچنین با توانایی تشخیص فلورسانس در نمونه‌ها در عمق تا عمق 1.5 میلی‌متری و توانایی کاهش چشمگیر اثر نامطلوب تشعشعات تحریک هم بر روی اجسام مورد مطالعه و هم بر روی گزارشگران فلورسنت متمایز می‌شوند.

اطلاعات کمی از تصاویر دیجیتال با استفاده از برنامه های کامپیوتری تجزیه و تحلیل تصویر استخراج می شود. شدت فلورسانس و توزیع فضایی آن اندازه‌گیری می‌شود، ویژگی‌های طیفی تابش ارزیابی می‌شود، تعداد ذرات فلورسنت، مانند سلول‌ها، تعیین می‌شود، و پارامترهای زمانی و قطبش فلورسانس مشخص می‌شوند. تکنیک های تحلیلی ویژه (به اصطلاح طیف سنجی همبستگی فلورسانس) امکان استفاده از میکروسکوپ کانفوکال و دو فوتونی را برای مطالعه حرکت حتی تک مولکول های فلورسنت فراهم می کند!

گزارشگران فلورسنت چه چیزی را در عالم صغیر برجسته کردند

گزارشگران فلورسنت سابقه طولانی موفقیت در بسیاری از حوزه‌های زیست‌شناسی تجربی، یا نه در همه آنها، دارند. با این حال، مناطقی وجود دارد که آنها نقش کلیدی ایفا کرده اند.

با استفاده از گزارشگرهای فلورسنت، مدلی از ساختار کریستالی مایع همه غشاهای بیولوژیکی به طور تجربی اثبات شد. با توجه به این مدل، غشاء با تمام یکپارچگی ساختاری خود به اندازه کافی "مایع" است به طوری که اجزای جداگانه آن می توانند در جهت درست حرکت کنند. این نمایش درک مکانیسم های مولکولی اساسی عملکرد غشاء و همچنین خواص سلول های زنده به طور کلی را ممکن می سازد.

تا حد زیادی، به لطف اطلاعات خبرنگاران فلورسنت، مکانیسم های تبدیل انرژی در سلول ها روشن شده است. فلوروفورها در اینجا نقش ویژه ای ایفا کردند و ثبت pH درون سلولی و داخل میتوکندری و همچنین تفاوت پتانسیل های الکتریکی در سراسر غشاها را ممکن می ساختند. با کمک آنها، اول از همه، مکانیسم ترکیب واکنش های اکسیداسیون اهداکننده انرژی با سنتز مصرف کننده انرژی آدنوزین تری فسفات (ATP)، یک منبع انرژی جهانی برای اکثر فرآیندهای متابولیک، آشکار شد. علاوه بر این، ماهیت تجمع مواد مختلف در سیتوپلاسم و اندامک‌های سلولی به دلیل پتانسیل الکتریکی غشاء و گرادیان pH مورد مطالعه قرار گرفت.

فعالیت حیاتی سلول ها توسط مجموعه ای از واکنش های بیوشیمیایی هماهنگ شده در فضا و زمان تامین می شود و به اصطلاح سیستم های سیگنالینگ مسئول هماهنگی هستند. اجزای اصلی این سیستم ها با استفاده از تکنیک های بیوشیمی مرسوم و زیست شناسی مولکولی جدا و مشخص شده اند. با این حال، تنها رویکردهای مبتنی بر استفاده از گزارشگران فلورسنت به طور مستقیم نشان می‌دهند که این مسیرها کجا قرار دارند و سیگنال‌ها چگونه از آنها عبور می‌کنند - امکان نظارت بر تعاملات پروتئین‌های سیگنال‌دهنده در زمان واقعی یا ارزیابی پویایی بیان ژن در یک سلول وجود داشت. با کمک گزارشگران فلورسنت، شناسایی اجزای سیگنال قبلا ناشناخته نیز امکان پذیر شد، به عنوان مثال، برای آشکار کردن نقش یون های Ca + 2 به عنوان یک واسطه سیگنال در بسیاری از واکنش های تنظیمی.

در نیمه دوم قرن بیستم، مشکلی در میکروبیولوژی به وجود آمد که به آن "ناهنجاری بزرگ شمارش میکروارگانیسم ها با استفاده از ظروف پتری" لقب گرفت. معلوم شد که "مقصران" خبرنگاران فلورسنت، دو رنگ اسید نوکلئیک - آکریدین نارنجی و 4،6-دیامیدینو-2-فنیلندول بودند. محتوای میکروارگانیسم‌ها در یک نمونه طبیعی را می‌توان با شمارش کلنی‌هایی که روی یک ظرف پتری رشد کرده‌اند (با رقیق‌سازی کافی "دانه" هر کلنی توسط فرزندان تنها یک سلول تشکیل می‌شود) یا با شمارش مستقیم خود میکروارگانیسم ها زیر میکروسکوپ، رنگ آمیزی شده با رنگ های فلورسنت اسیدهای نوکلئیک. بنابراین، خبرنگاران فلورسنت همیشه میکروارگانیسم‌های بیشتری را نسبت به تجزیه و تحلیل با ظروف پتری شناسایی کرده‌اند.

دو فرضیه برای توضیح این تناقض مطرح شده است. طبق اولی، برخی از سلول هایی که در حالت استراحت هستند، روی ظروف پتری تکثیر نمی شوند. طبق دوم، شرایط کشت (ترکیب متوسط، دما و ...) با نیاز بخشی از جمعیت مطابقت ندارد. آزمون این فرضیه ها نشان داد که هر دو ممکن است. علاوه بر این، انگیزه ای برای شکل گیری دو خط اصلی جدید تحقیقاتی داده شد. اولین مورد مربوط به مطالعه وضعیت به اصطلاح زنده اما کشت نشده میکروارگانیسم ها است. اهمیت عملی چنین مطالعاتی واضح است: به عنوان مثال، پاتوژن های انسانی در این حالت ممکن است برای روش های تشخیصی استاندارد نامرئی باشند و در برابر داروها مقاوم تر باشند. جهت دوم، شناسایی و مطالعه میکروارگانیسم‌ها در نمونه‌های طبیعی با تجزیه و تحلیل مستقیم اسیدهای نوکلئیک آنها، بدون به دست آوردن کشت خالص اولیه، همانطور که قبلا انجام شد، است. این جهت نام خاص خود را دریافت کرده است - متاژنومیکس. به لطف روش های متاژنومیکس (به هر حال، برخی از این روش ها شامل استفاده از گزارشگرهای فلورسنت می شود)، مشاهده تنوع بیولوژیکی میکروارگانیسم ها در اکوسیستم های فردی و روی زمین به روشی جدید امکان پذیر شد.

بنابراین، خبرنگاران فلورسنت مدرن ارتش عظیمی از متخصصان هستند، و بسیاری از آنها در حال حاضر شهرت زیادی در زیست شناسی تجربی دارند. گزارش‌های آن‌ها این امکان را فراهم می‌آورد که آن گوشه‌هایی از کیهان کوچک را که نور می‌تواند در آن نگاه کند، بهتر دیده شود. با این حال، بسیاری از محققانی که در این زمینه کار می کنند، معتقدند که هر آنچه که تاکنون در پرتو فلورسانس دیده ایم، تنها آغاز راه است!

لومینسانس پس از جذب نور رخ می دهد و یک انتقال تابشی از حالت های برانگیخته الکترونیکی به حالت پایه است. بسته به ماهیت زمین و حالت های برانگیخته، لومینسانس را می توان به دو نوع تقسیم کرد. همانطور که مشخص است اسپین های الکترون ها که یکی از آنها در حالت منفرد زمینی و دومی در حالت تک تک برانگیخته قرار دارد، جهت گیری های مخالف دارند (اسپین های الکترون زوجی هستند). انتقال یک الکترون از حالت منفرد برانگیخته به حالت منفرد پایه از نظر مکانیکی کوانتومی مجاز است، زیرا در این مورد تغییری در جهت اسپین نباید رخ دهد. وضعیت متفاوتی برای حالت سه گانه مشاهده می شود که در آن اسپین الکترون جهت گیری یکسانی با اسپین الکترون در حالت منفرد زمین دارد. بنابراین، انتقال یک الکترون از حالت سه گانه به حالت تک پایه، مستلزم تغییر جهت اسپین الکترون است. و این فرآیند از نظر مکانیکی کوانتومی ممنوع است.

بدیهی است، برای این دو نوع انتقال الکترون، نرخ انتشار باید به طور قابل توجهی متفاوت باشد. در واقع، برای انتقال‌های تک تکی مجاز مکانیکی کوانتومی، نرخ انتشار معمولی ~ 108 s-1 است که مربوط به زمان فروپاشی لومینسانس ~ 10-8 ثانیه است. به این نوع لومینسانس فلورسانس می گویند. نوع دوم لومینسانس فسفرسانس نامیده می شود - و گسیلی است که در طی انتقال بین حالت های چندگانه مختلف، معمولاً از حالت سه گانه برانگیخته به حالت منفرد رخ می دهد. از آنجایی که این انتقال ها از نظر مکانیکی کوانتومی ممنوع هستند، محدوده معمول زمان واپاشی فسفرسانس از میکروثانیه تا ثانیه متغیر است، که عمدتاً به مشارکت سایر فرآیندهای غیرفعال کردن انرژی الکترون در حالت برانگیخته بستگی دارد. بنابراین، بسته به مدت زمان پس تابش، لومینسانس را می توان به فلورسانس و فسفرسانس تقسیم کرد.

فرآیندهای جذب و گسیل نور، صرف نظر از تغییر مختصات هسته ای، را می توان به وضوح با استفاده از نمودار یابلونسکی نشان داد (شکل 1 را ببینید).

برنج. 1. نمودار Yablonsky که سطوح انرژی را نشان می دهد
مولکول ها و نرخ های انتقال خطوط مستقیم - انتقال تابشی،
موجی - انتقال غیر تشعشعی

حالت منفرد زمین و حالت تک تک برانگیخته اول و دوم به ترتیب با S0، S1، S2 نشان داده می شوند. هر یک از این سطوح انرژی می تواند از سطوح فرعی ارتعاشی زیادی تشکیل شده باشد که به نوبه خود از سطوح فرعی چرخشی زیادی تشکیل شده اند (در شکل 1 نشان داده نشده است).

با توجه به توزیع بولتزمن، در دمای اتاق، بیشتر مولکول‌ها در پایین‌ترین سطح ارتعاشی حالت تک تک زمینی S0 قرار دارند. دقیقاً چنین مولکول هایی هستند که عمدتاً جذب می شوند
تابش می کند.

بنابراین، تحریک معمولاً از حالت منفرد زمینی S0 به سطوح مختلف ارتعاشی حالت‌های منفرد برانگیخته Sn (n = 1، 2، …) رخ می‌دهد. انتقال بین سطوح فرعی مختلف به صورت خطوط مستقیم نشان داده شده است. این نمایش برای نشان دادن ماهیت آنی جذب نور استفاده می شود. این فرآیند در یک زمان به ترتیب دوره نوسانات نور انجام می شود، یعنی. در حدود 10-15 ثانیه در این مدت، هسته ها دچار جابجایی محسوسی نمی شوند (اصل فرانک-کاندون).

علاوه بر این، برای مولکول‌ها در فاز متراکم، محتمل‌ترین فرآیند انتقال آن‌ها از حالت‌های منفرد برانگیخته به پایین‌ترین سطح ارتعاشی حالت برانگیخته S1 است که به دلیل انتقال سریع غیر تشعشعی (تبدیل داخلی) در زمانی از مرتبه فمتوثانیه است. از آنجایی که زمان فروپاشی فلورسانس معمولی نزدیک به 10-8 ثانیه است، تبدیل داخلی معمولاً قبل از رویداد انتشار به پایان می رسد. بنابراین، انتشار فلورسانس اغلب از یک حالت برانگیخته تعادل حرارتی انجام می شود.

انتقال تابشی معکوس الکترون‌ها (فلورسانس)، مشابه عمل جذب، می‌تواند به سطوح ارتعاشی مختلف حالت منفرد زمینی S0 با سرعت Kph رخ دهد. پس از آن، آنها به صورت غیر تشعشعی به سطح ارتعاش اصلی برای زمان های مرتبه 10-12 ثانیه غیرفعال می شوند.

مولکول ها در حالت S1 نیز می توانند تحت انتقال های دیگری قرار گیرند. به عنوان مثال، انتقال غیر تشعشعی (تبدیل داخلی) به حالت S0 با نرخ Kvc، انتقال انرژی غیر تابشی به مولکول های همسایه با نرخ Kpe امکان پذیر است. علاوه بر این، مولکول‌های حالت S1 می‌توانند با سرعت Kkk به حالت سه‌گانه T1 تبدیل شوند. علاوه بر این، انتقال تابشی مولکول از حالت سه گانه به حالت تک پایه (فسفرسانس) امکان پذیر است. با این حال، همانطور که قبلا ذکر شد، چنین انتقالی از نظر مکانیکی کوانتومی ممنوع است، در نتیجه ثابت سرعت فسفرسانس چندین مرتبه کوچکتر از ثابت مربوط به فلورسانس است.

مجموع تمام سرعت های جنبشی با طول عمر τ حالت برانگیخته S1 نسبت معکوس دارد، یعنی:

این نسبت بازده کوانتومی فلورسانس است. انتشار فلورسانس همچنین می تواند تحت تأثیر عوامل دیگری مانند خاموش شدن لومینسانس، اثر یک حلال و غیره قرار گیرد.

این اثر در نامزدی "بهترین مقاله مروری" مسابقه "" -2014 مقام اول را کسب کرد.

همانطور که می دانید یک بار سبکبا موفقیت جدا شد تاریکی. تاریکی چیست هنوز قابل درک نیست. تاکنون تنها چشم اندازهایی در این راستا در ارتباط با مطالعه بیان شده است ماده تاریکو انرژی تاریک. اما بشریت برای مدت طولانی با موفقیت مطالعه و از نور استفاده کرده است، از جمله به عنوان یک "ابزار" تحقیقاتی. یکی از روش های استفاده از نور در مطالعات تجربی مربوط به پدیده است فلورسانسدر طول سی سال گذشته، استفاده از روش های مختلف مبتنی بر تشخیص فلورسانس در تحقیقات بیولوژیکی و پزشکی به سرعت رشد کرده است. این به دلیل ظهور قابلیت‌های فنی جدید - در درجه اول رایانه‌ها و لیزرها - و طیف وسیعی از مولکول‌های فلورسنت و مجتمع‌های مولکولی موجود است. مثل اینکه خبرنگاران میکروسکوپیاین ترکیبات با سیگنال های نوری خاصی در مورد خواص دنیای مولکولی که در آن قرار دارند به ما می گویند. روش شناسی فلورسنت راه حل هایی را برای بسیاری از مشکلات اساسی زیست شناسی و پزشکی ارائه کرده است. به دلیل حساسیت بالا و ایمنی نسبی، جایگزین بسیاری از روش های سنتی مرتبط با استفاده از مواد رادیواکتیو شده است. روش های آنالیز فلورسنت هم در تحقیقات بنیادی برای به دست آوردن دانش جدید در مورد موجودات زنده و هم در کارهای کاربردی در بیوتکنولوژی، تشخیص پزشکی، علم پزشکی قانونی و بسیاری از زمینه های دیگر استفاده می شود. خبرنگاران فلورسنت چیست؟ چه اطلاعاتی را می توان با کمک آنها از اعماق جهان خرد به دست آورد؟ این اطلاعات چگونه ثبت و تجزیه و تحلیل می شود؟ اما اول از همه - فلورسانس چیست؟

فلورسانس: لومینسانس ناشی از نور

برخی از مواد پس از جذب نور در یک محدوده طول موج مشخص، شروع به جذب می کنند تابش می کندنور در یک محدوده طول موج متفاوت و طولانی تر. برای اولین بار، این پدیده به عنوان یک تغییر قابل مشاهده در رنگ محلول های برخی از ترکیبات آلی و مواد معدنی هنگامی که نه از طریق انتقال (در نور عبوری)، بلکه در زاویه ای نسبت به نور عبوری مشاهده می شود، توصیف شد. بنابراین، به عنوان مثال، دیوید بروستر (سر دیوید بروستر) در سال 1833 متوجه شد که وقتی محلول سبز الکلی کلروفیل با نور سفید روشن می شود، نور قرمز از آن "انعکاس" می یابد. بعدها، در سال 1845، جان هرشل (سر جان هرشل) مشاهدات مشابهی را توصیف کرد - ظاهر یک رنگ آبی در محلول بی رنگ سولفات کینین در هنگام تابش نور خورشید. در سال 1852، جرج گابریل استوکس کشف کرد قابل رویتدرخشش یک ماده معدنی فلوریتزمانی که تحت تابش قرار می گیرد نامرئیاشعه ماوراء بنفش. وی با توجه به منشا درخشش مشاهده شده، این پدیده را نامید فلورماهیت، همانطور که او اشاره کرد، با قیاس با این اصطلاح عقیق Escension توصیف کننده پدیده دورنگیدر رسوایی. توجه به این نکته ضروری است که این اصطلاحات نه تنها منعکس کننده "تاریخ" منشأ آنها هستند، بلکه مهمتر از آن، نشان دهنده پدیده های فیزیکی مختلف هستند. فلورسانس- آی تی تابش - تشعشع، که در مولکول های یک ماده تحت تأثیر نور به وجود می آید. اپالسانس -آی تی پراکندگینور که گاهی با تداخل همراه است.

در اصل فلورسانس یکی از انواع آن است لومینسانساین اصطلاح تمام پدیده های تابش یک ماده را توصیف می کند که در اثر "تحریک" مولکول ها توسط عوامل مختلف ایجاد می شود. به عنوان مثال، در برخی از واکنش های شیمیایی، همیلومینسانس نورتابی شیمیایی در اجسام بیولوژیکی نامیده می شود زیستیلومینسانس*. موادی وجود دارند که هنگام تحریک توسط جریان الکتریکی نور ساطع می کنند ( الکترولومینسانس)، الکترون های سریع ( کاتدولومینسانس)، تابش γ ( رادیولومینسانس) و دیگران. در این زمینه، فلورسانس طبقه بندی می شود عکسلومینسانس

* - اخیراً مقاله شگفت انگیزی در مورد "بیومولکول" منتشر شده است که کشف نوع جدیدی از بیولومینسانس را توصیف می کند: « » . - اد.

اتم ها، مولکول ها و کمپلکس های مولکولی که قادر به فلورسانس هستند نامیده می شوند فلوروفورهایا فلوروکروم ها. معمولاً از این اصطلاحات به عنوان مترادف استفاده می شود. با این حال، در تعدادی از منابع، فلوئوروکروم ها به معنای همه انواع مولکول های فلورسنت و فلوروفورها تنها به معنای جزء فلورسنت (گروه بندی) یک مولکول بزرگ در نظر گرفته شده است. در مونوگراف کلاسیک J. R. Lakowitz، تنها یک اصطلاح استفاده می شود - فلوروفور، برای همه انواع مواد فلورسنت. به منظور سازگاری، از این اصطلاح استفاده خواهیم کرد. ما همچنین توجه می کنیم که در عمل تحقیقاتی، معمولاً یک جزء فلورسنت که به طور کووالانسی به یک ماکرومولکول متصل است، نامیده می شود. برچسب فلورسنتو فلوروفور رایگان پویشگر. فلوروفورهای مورد استفاده در میکروسکوپ به طور سنتی به عنوان نامیده می شوند رنگ های فلورسنت. سرانجام، برخی از نویسندگان شروع به استفاده از این اصطلاح کردند حسگرهای زیستیدر رابطه با فلوروفورهای مورد استفاده در تحقیقات بیولوژیکی.

ماهیت فیزیکی فلورسانس را می توان به راحتی با استفاده از نموداری که الکساندر جابلونسکی فیزیکدان لهستانی در سال 1933 ارائه کرد و نام او را نشان داد، نشان داد. شکل 1 شکل ساده شده ای از این نمودار را نشان می دهد.

شکل 1. نمودار Yablonskyنشان دادن فرآیندهای الکترونیکی در مولکول های فلوروفور در طول جذب کوانتوم های نور. خطوط افقی- سطوح انرژی الکترونها: S0- حالت اولیه، غیر هیجان زده؛ S1- حالت هیجانی تکی؛ 0–3 - سطوح فرعی کوانتیزه شده T 1, T 2سطوح کوانتیزه حالت برانگیخته سه گانه هستند. فلش‌ها انتقال الکترون‌ها به حالت‌های مختلف انرژی را نشان می‌دهند: پ- جذب نور، fl, فسف- انتشار فلورسانس و فسفرسانس به ترتیب، VC- تبدیل داخلی، IR- تبدیل ترکیبی، BP- آرامش ارتعاشی

وقتی فوتون‌های انرژی معینی در یک مولکول فلوروفور جذب می‌شوند، الکترون‌ها از "زمین" (S 0) به یکی از سطوح فرعی حالت "برانگیخته" (S 1، S 2، ...، Sn) عبور می‌کنند. یک انرژی بالاتر اسپین الکترون در طول انتقال تغییر نمی کند و به همین دلیل به این سطوح منفرد می گویند. حالت "تحریک" ناپایدار است و الکترون ها به سرعت به سطح انرژی اولیه خود باز می گردند. این می تواند از چند طریق اتفاق بیفتد. سه مورد از آنها انتقال کوانتومی غیر تابشی هستند: تبدیل داخلی، تبدیل ترکیبیو آرامش ارتعاشی. دو مورد دیگر با انتشار نور همراه هستند - اینها هستند فلورسانسو فسفرسانس. در طول تبدیل داخلی، انرژی الکترون به حداقل سطح منفرد کاهش می یابد. در طول آرامش ارتعاشی، که عمدتاً به دلیل برهمکنش با مولکول‌های اطراف ایجاد می‌شود، انرژی جذب‌شده می‌تواند به صورت گرما به سطح «زمین» پخش شود. تبدیل بین سیستمی منجر به کاهش انرژی الکترون ها با تغییر در اسپین می شود. این حالت انرژی یک الکترون سه گانه نامیده می شود. فلورسانس پس از انتقال از سطح منفرد پایین به حالت "زمین" و فسفرسانس پس از انتقال به حالت "زمین" از سطح سه گانه رخ می دهد.

ما به سه واقعیت مهم اشاره می کنیم.

اول، احتمالات انتقال فوق متفاوت است. ایده ای از این با مقایسه زمانی که در طی آن هر یک از این انتقال ها اتفاق می افتد، به عبارت دیگر، زمان صرف شده توسط الکترون ها در هر یک از این حالت ها ارائه می شود (جدول 1). هر چه زمان کوتاه تر باشد، احتمال این انتقال بیشتر است. واضح است که فلورسانس و حتی بیشتر از آن فسفرسانس فرآیندهای بعید هستند. این امر در لومینسانس نسبتا ضعیف اکثر فلوروفورها حتی تحت تابش شدید آشکار می شود.
ثانیاً، از آنجایی که فلورسانس زمانی امکان پذیر است که الکترون ها فقط از پایین ترین سطح منفرد به حالت "زمین" عبور کنند، انرژی تابش کمتر از انرژی جذب شده است. بنابراین، طیف فلورسانس یک فلوروفور در مقایسه با طیف جذبی همیشه در ناحیه طول موج بلندتری قرار دارد.
و در نهایت، ثالثاً، وضعیت الکترون‌های درگیر در فرآیندهای فوق هم به عوامل فیزیکی محیط و هم به پیکربندی الکترونیکی کلی مولکول بستگی دارد. این شرایط است که فلوئوروکروم را می سازد گزارشگر مولکولی، که "به زبان" فلورسانس شرایط فیزیکوشیمیایی محیط خود را گزارش می کند.

"زبان" خبرنگاران فلورسنت

فلورسانس با تعدادی پارامتر مشخص می شود که بسته به محیط فیزیکی یا تغییر شیمیایی فلوروفور متفاوت است. این پارامترها "زبان" هستند که در آن اطلاعات از گزارشگر فلورسنت منتقل می شود. اگر قیاس را ادامه دهیم، خود پارامترها، مانند کلمات، تنها با ترکیب خاصی از آنها و در متن، معنای خاصی پیدا می کنند. "زمینه" پارامترهای فلورسانس شرایط ثبت آنها است. فلورسانس همه فلوروفورها دارای پنج ویژگی کلیدی است: طیف جذبی و فلورسانس، و همچنین بازده کوانتومی، طول عمر و ناهمسانگردی فلورسانس.

هر فلوروفور فردی دارد طیف جذبی و فلورسانس . برای مثال، شکل 2 طیف Lyso Tracker TM Blue (Molecular Probes®) و فلورسین را نشان می دهد. پارامترهای اصلی طیف عبارتند از: شدت فلورسانس، موقعیت ماکزیمم و اصطلاحاً نیمه عرض (عرض طیف در سطح نیمه حداکثر). اغلب این پارامترها هستند که در مورد ویژگی های خاصی از محیطی که گزارشگر در آن قرار دارد "اطلاع می دهند". بنابراین، تغییرات مشخصه در طیف فلورسانس بسیاری از فلوئوروکروم ها در مقادیر مختلف pH رخ می دهد. شکل 2 وابستگی pH طیف فلورسانس Lyso Sensor TM Yellow/Blue (Molecular Probes®) را به عنوان مثال نشان می دهد. اگر چنین تغییراتی خاص باشد، به عنوان مثال. فقط می تواند توسط تغییرات pH ایجاد شود، پس این فلوروفور می تواند یک گزارشگر pH باشد. Lyso Sensor TM Yellow/Blue یکی از این گزارشگران است.

بازده کوانتومی فلورسانس ویژگی بازدهی است که با آن انرژی جذب شده در مقایسه با فرآیندهای آرامش غیر تشعشعی به تشعشع تبدیل می شود. از نظر کمی، بازده کوانتومی به عنوان نسبت تعداد فوتون های ساطع شده به تعداد فوتون های جذب شده تعریف می شود. هرچه بازده کوانتومی بیشتر باشد، شدت انتشار فلوروفور بیشتر است. اغلب این شاخص هنگام انتخاب یک فلوروفور برای نقش یک گزارشگر فلورسنت تعیین کننده است. به عنوان مثال، فلورسین بازده کوانتومی حدود 0.9 دارد که استفاده گسترده از آن را هم به عنوان یک کاوشگر مستقل و هم به عنوان یک برچسب فلورسنت برای مولکول های غیر فلورسنت تضمین می کند. همچنین مهم است که این شاخص نسبت به فعل و انفعالات مختلف فیزیکوشیمیایی گزارشگر بسیار حساس باشد.

طول عمر فلورسانس میانگین زمانی است که در طی آن مولکول های فلوروفور قبل از انتشار فوتون های فلورسانس در حالت برانگیخته هستند. این شاخص با فروپاشی فلورسانس پس از یک تحریک کوتاه اندازه گیری می شود. طول عمر فلورسانس، از یک سو، بسیار "حساس" به "محیط" فیزیکوشیمیایی است که گزارشگر فلورسنت در آن قرار دارد. از طرف دیگر، این نشانگر یک ویژگی خاص فلوروفور است که امکان به دست آوردن "گزارش" از آن را در حضور سایر مولکول های فلورسنت با ویژگی های طیفی مشابه می دهد.

ناهمسانگردی فلورسانس یک مشخصه کمی از وابستگی قطبش فلورسانس به قطبش نور هیجان انگیز است. بر اساس ناهمسانگردی، می توان تحرک چرخشی گزارشگر و بنابراین، ویسکوزیته محیط در ریزمحیط آن را قضاوت کرد.

پنج پارامتر فلورسانس بالا مشخصه های قابل اندازه گیری مستقیم تشعشعی هستند که گزارشگران "انتقال می دهند". با این حال، توانایی های اطلاع رسانی گزارشگران فلورسنت به این محدود نمی شود. تعدادی از پدیده ها با فلورسانس مرتبط هستند که به عنوان "ترفندهای" روش شناختی برای به دست آوردن این یا آن اطلاعات از خبرنگاران فلورسنت استفاده می شود.

به عنوان مثال، پدیده انتقال انرژی غیر تابشی (رزونانسی) (BET) از یک فلوروفور به دیگری وجود دارد. در این حالت، شدت فلورسانس دهنده انرژی کاهش می یابد، در حالی که گیرنده افزایش می یابد. این می‌تواند بین فلوروفورهایی با ویژگی‌های طیفی خاص اتفاق بیفتد، و این امر به ویژه مهم است، اگر آنها در فاصله کافی نزدیک باشند. WPE زیربنای بسیاری از رویکردهای روش شناختی است که امکان آشکارسازی تعامل مولکول ها را فراهم می کند. تعیین کارایی انتقال انرژی غیر تابشی حتی به فرد امکان می دهد فاصله بین مولکول ها را تخمین بزند. به همین دلیل، WPE گاهی اوقات به عنوان یک خط کش مولکولی شناخته می شود (نگاه کنید به: « » ).

تعدادی از احتمالات روش شناختی مبتنی بر خاموش کردن فلورسانس است. کوئنچ می تواند در اثر تعامل فیزیکی فلوروفور با مولکول های خاموش کننده مانند اکسیژن، هالوژن ها، آمین ها و برخی مولکول های آلی «کمبود الکترون» ایجاد شود. در این مورد، گزارشگر فلورسنت می تواند وجود برخی از «کوئنچرها» را در محیط خود «گزارش» کند.

خاموش شدن فلوروفور همچنین می تواند به دلیل سفید شدن نور تحت تأثیر تشعشعات با شدت بالا رخ دهد. در اغلب موارد، از نقطه نظر ثبت فلورسانس، این یک پدیده منفی است. با این حال، "در دستان توانا" این پدیده به عنوان یک تکنیک روش شناختی خاص استفاده می شود. در مطالعه ویسکوزیته و/یا خواص انتشار سیتوپلاسم سلول ها، روش بازیابی فلورسانس فلوروفور پس از فوتوبلیچینگ گسترده شده است. ماهیت آن در این واقعیت نهفته است که در ناحیه کوچکی از سلول حاوی فلوروفور، توسط یک فلاش لیزری قدرتمند کوتاه مدت سفید می شود. سپس، بازیابی فلورسانس در همان ناحیه ثبت می‌شود که به دلیل انتشار مولکول‌های فلوروفور سفید نشده از سایر نواحی سلول است. دینامیک این فرآیند ویژگی های انتشار سیتوپلاسم را مشخص می کند.

خبرنگاران فلورسنت، چه هستند؟

بسیاری از مواد با پیکربندی های الکترونی خاص توانایی فلورسانس را دارند. چنین پیکربندی هایی در برخی اتم ها، مولکول ها و کمپلکس های فوق مولکولی تشکیل می شوند. با این حال، مطالعات خاصی برای شناسایی «توانایی» بالقوه فلوروفور برای عمل به عنوان گزارشگر مولکولی برای تحقیقات بیولوژیکی و پزشکی مورد نیاز است. این "توانایی ها" با توجه به ویژگی اطلاعاتی که منتقل می کنند، پایداری آنها، در درجه اول پایداری نور، در برخی موارد، سمیت برای سلول ها یا ارگانیسم های منفرد در نظر گرفته می شود. یکی از ویژگی های "خبرنگاران" فلورسنت "تخصص" بالای فردی آنهاست. "تخصص" هر گزارشگر با تعامل با اجزای خاصی از سیستم بیولوژیکی و همچنین با ویژگی سیگنال های فلورسنت مشخص می شود. به طور مشروط می توان دو گروه از گزارشگران ایجاد شده بر اساس را تشخیص داد ارگانیک. آلیو غیر معدنیفلوروفورها

مولکول های فلوروفور آلینماینده پرتعدادترین و متنوع ترین گروه از خبرنگاران فلورسنت است. با نگاهی به کاتالوگ Molecular Probes، شرکتی که از سال 1975 در توسعه و تولید فلوروفورها تخصص دارد، می توان به میزان زیاد این تنوع پی برد. این در حال حاضر یازدهمین ویرایش (به روز رسانی) کاتالوگ (در زمان نگارش) است که نشان دهنده سرعت بالای توسعه در این زمینه است.

طیف گسترده ای از گزارشگرهای فلورسنت آلی به دلیل طیف گسترده ای از وظایف و شرایط کاربرد آنها است. هنگام انتخاب یا طراحی گزارشگران، به اطلاعاتی که باید به دست آید، خواص طیفی فلوروفور و شرایط ویژه مرتبط با سیستم مورد مطالعه توجه می شود. اجازه دهید این را با مثال فلورسین و مشتقات آن نشان دهیم (شکل 4). همانطور که قبلا ذکر شد، این فلوروفور دارای بازده کوانتومی بالا و بر این اساس، فلورسانس روشن است. می تواند به عنوان گزارشگر pH عمل کند. اما به عنوان مثال برای اندازه گیری PH داخل سلول ها مناسب نیست، زیرا به غشای سیتوپلاسمی نفوذ نمی کند. "تحویل" آن به سلول ها را می توان با استفاده از یک مشتق آبگریز - دی استات فلورسین انجام داد که توانایی فلورسانس را از دست داده است، اما می تواند به سد آبگریز غشای سیتوپلاسمی نفوذ کند. در سلول ها، استرازها گروه های استیل را جدا می کنند و فلورسین در سلول ها ظاهر می شود. دی کلروفلورسئین به روشی مشابه به سلول ها تحویل داده می شود. از طریق مشتق استری شده این گزارشگر برای ثبت حضور گونه های فعال اکسیژن در سلول ها خدمت می کند. ورود ایزوتیوسیانات به مولکول فلورسین، اتصال فلوروکروم به گروه های آمینه مولکول های غیر فلورسنت را ممکن می سازد. با استفاده از فلورسئین ایزوتیوسیانات، گزارشگرهای پروتئین فلورسنت بسیار خاص ایجاد می شود - آنتی بادی های مختلف، استرپتاویدین (معرف بیوتین)، و همچنین نوکلئوتیدها و الیگونوکلئوتیدها. در نهایت، فلورسین 5-کربوکسی متوکسی-2-نیتروبنزیل استر (در شکل 4 نشان داده نشده است) یک مشتق غیر فلورسنت است که می تواند با تابش نور 355 نانومتر به فلورسین معمولی تبدیل شود. این نمونه ای از فلوروفورهای فعال شده با نور است که خواص فلورسنت آن قبل از تابش به نوعی "پنهان" (به انگلیسی "Caged") است.

شکل 4فرمول های ساختاری فلورسین و برخی از مشتقات آن

در دهه هفتاد قرن بیستم، یکی از کارمندان دانشگاه پرینستون (ایالات متحده آمریکا) اسامو شیمومورا ( اسامو شیمومورا) هنگام مطالعه بیولومینسانس یک چتر دریایی اکوریا ویکتوریادو پروتئین درگیر در این فرآیند را شناسایی کرد. او دریافت که وقتی یون های کلسیم با یکی از پروتئین های جدا شده برهم کنش می کنند، نورتابی شیمیایی آبی رخ می دهد. در این حالت، پروتئین دوم می تواند نور آبی را جذب کند و با نور سبز فلورسانس کند، که به چتر دریایی درخششی مایل به سبز می دهد. اولین پروتئین آکورین، دومین پروتئین فلورسنت سبز (GFP) نام داشت. از این لحظه تاریخ یکی از موفق ترین پیشرفت ها در زیست شناسی مولکولی آغاز می شود و شخصیت های اصلی آن اوسامو شیمومورا، مارتین چالفی هستند. مارتین چالفی) و راجر تسین ( راجر تسین) در سال 2008 جایزه نوبل شیمی را برای کشف و مطالعه دقیق ZFB دریافت کردند. چه چیزی در مورد این پروتئین قابل توجه است؟

پس از کشف ZFB، مطالعات فشرده بر روی ساختار آن آغاز شد و ژن مربوط به آن سنتز و شبیه سازی شد. علاوه بر این، برخی از بی مهرگان دریایی ( Hydrozoaو آنتوزوآ) پروتئین های فلورسنت مشابهی پیدا شد که ساختار آنها نیز مشخص شد. همه اینها با استفاده از روش‌های زیست‌شناسی مولکولی، امکان ساخت هدفمند ژن‌هایی را فراهم کرد که اشکال اصلاح‌شده GFP را با طیف گسترده‌ای از ویژگی‌های طیفی، و همچنین گونه‌های تنظیم‌شده نوری، که می‌توان درخشندگی آن‌ها را با تابش با تابش «روشن و خاموش» کرد، کدگذاری کرد. اشعه ماوراء بنفش. در حال حاضر، می توان گفت که بر اساس GFP، یک "ارتش" کامل از پروتئین های فلورسنت مختلف (FP) ایجاد شده است و به رشد خود ادامه می دهد. امکان استفاده از FB در مطالعات بسیاری از انواع سلول ها از باکتری گرفته تا پستانداران نشان داده شده است.

"سرنوشت" اکورین در مقایسه با ZFB هنوز تا حدودی "متواضع" به نظر می رسد. ساختار آن نیز مشخص شده است و DNA کد کننده این پروتئین سنتز شده است. مطالعه وابستگی نورتابی شیمیایی آکورین به یون های کلسیم امکان توسعه روش هایی را برای اندازه گیری غلظت کاتیون در برخی سلول ها فراهم کرد. برای اندازه گیری محتوای یون های کلسیم در داخل سلول ها، گزارشگرهای فلورسنت از جمله مشتقات FB نیز وجود دارد. با این حال، مزیت روش نورتابی شیمیایی با استفاده از اکورین عدم نیاز به تابش تحریک‌کننده فلورسانس است که همیشه برای سیستم بیولوژیکی بی‌ضرر نیست و برای فلوروفورها که درخشندگی آنها با تابش طولانی مدت ضعیف می‌شود (اثر فتوبلیچینگ). ). Aequorin متعلق به گروه نسبتاً بزرگی از به اصطلاح لوسیفرین ها است - موادی که مسئول لومینسانس زیستی (شیمیایی) در برخی از موجودات دریایی و زمینی هستند. مطالعه لوسیفرین ها نه تنها به منظور کاربرد عملی آنها مورد توجه است. از این گذشته، هنوز مشخص نیست که چرا اجسام بیولوژیکی اصلاً به بیولومینسانس نیاز دارند.

در سال های اخیر، افزایش قابل توجهی در علاقه به توسعه گزارشگران فلورسنت بر اساس وجود داشته است غیر معدنیفلوروفورها با تشکیل به اصطلاح بیوکونژوگه ها،آن ها کمپلکس های آنها با ترکیبات آلی خاص و/یا با مولکول های بیولوژیکی. بسیاری از اتم ها، به عنوان مثال، فلزات واسطه، لانتانیدها (به طور دقیق تر، یون های آنها، به عنوان مثال، Tb 3 + و Eu 3)، خوشه های چند اتم طلا و نقره، پس از تشکیل چنین مجتمع هایی، توانایی به دست آوردن حساس شدهفلورسانس ماهیت این پدیده در این واقعیت نهفته است که انرژی نور جذب شده توسط یک ترکیب آلی به اتم یک عنصر معدنی منتقل می شود که فلورسانس ساطع می کند. یکی از ویژگی های مهم این فرآیند این است که مولکول های دهنده انرژی انرژی را از الکترون ها در حالت سه گانه انتقال می دهند. بنابراین، تشعشعات غیر معدنیفلوروفورها در چنین کمپلکسی در مقایسه با فلورسانس معمولی "آهسته" است، زیرا طول عمر الکترون ها در حالت سه گانه به طور قابل توجهی بیشتر از حالت منفرد است (جدول 1 را ببینید). علاوه بر این، طیف فلورسانس بیوکونژوگه های معدنی دارای عرض کمی هستند و به شدت نسبت به طیف جذب جابجا می شوند. فلورسانس حساس گزارشگرهای بیوکونژوگه آنها را از نظر تکنیک های تشخیص تشعشع "مفید" می کند. بنابراین، به ویژه، آنها در شرایطی استفاده می شوند که سیستم مورد مطالعه دارای فلورسانس "عادی" سایر اجزا در محدوده طول موج یکسان باشد.

جایگاه ویژه ای در این گروه را گزارشگران بیوکونژوگه ای اشغال کرده اند که در آن از کریستال های نیمه هادی با اندازه 2 تا 10 نانومتر (نانوکریستال) به عنوان فلوروفور استفاده می شود که به آنها نقاط کوانتومی* (انگلیسی) نقاط کوانتومی). نقاط کوانتومی معمولاً از یک جفت عنصر گروه III/V (مانند CdS، CdSe، ZnS) یا عناصر گروه II/VI (مانند GaN، InP، InAs) تشکیل شده‌اند. به دلیل اندازه کوچک کریستال های نیمه هادی (آنها فقط 10 تا 50 اتم دارند!) شرایطی برای انتقال انرژی کوانتیزه شده برای الکترون های آنها ایجاد می شود، مشابه شرایطی که در اتم های منفرد وجود دارد. (حتی گاهی اوقات به نقاط کوانتومی "اتم های مصنوعی" نیز گفته می شود). علاوه بر این، انرژی این انتقال ها و در نتیجه طول موج فلورسانس به اندازه کریستال بستگی دارد. هر چه کریستال کوچکتر باشد، انرژی تابش بیشتر است، یعنی. طول موج فلورسانس کوتاه تر (شکل 5). این ویژگی امکان ایجاد نقاط کوانتومی با تقریباً هر پیکربندی طیفی را باز می کند. به این باید اضافه کرد که در مقایسه با فلوروفورهای آلی، عملکرد کوانتومی و پایداری نوری بالاتری نیز دارند. روی انجیر شکل 6 ابعاد تقریبی انواع فلوروفورهای گزارشگر را نشان می دهد.

* - چه کسی این نام را مجذوب خود کرده است، مقاله مفصل را بخوانید « » . - اد.

شکل 5فلورسانس محلول های کلوئیدی نقاط کوانتومی با اندازه های مختلف.

بیوکونژوگه های مبتنی بر نقاط کوانتومی شامل یک هسته (به عنوان مثال، CdSe) پوشیده شده با لایه ای از مواد نیمه رسانا (به عنوان مثال، ZnS) است که عملکرد "محافظتی" را انجام می دهد، و یک لیگاند - نوعی ماده آلی که حلالیت و / یا اتصال مولکول های بیولوژیکی

شکل 6اندازه های نسبی گزارشگرهای فلورسنت. برای مقایسه، پروتئین ایمونوگلوبولین G (Ig G) نیز نشان داده شده است.

پوسته بیو ارگانیک بیوکونژوگه ثبات آن را به عنوان یک ذره کلوئیدی تضمین می کند و "وظیفه" گزارشگر، هدف مورد نظر آن را تشکیل می دهد: کجا و با چه چیزی تعامل داشته باشد، چه نوع "جمع آوری و انتقال" اطلاعات. در این مورد، البته، ابعاد یک گزارشگر بر اساس یک نقطه کوانتومی می تواند به طور قابل توجهی افزایش یابد (شکل 6 ابعاد تقریبی نقاط کوانتومی را بدون "تجهیزات" بیوکونژوگه نشان می دهد). پوسته بیورگانیک می تواند شامل ترکیبات با وزن مولکولی کم - مانند بیوتین - و ترکیبات با وزن مولکولی بالا باشد: قطعات DNA تک رشته ای (الیگونوکلئوتیدها) و پروتئین ها، از جمله آنزیم ها و آنتی بادی ها (Ig G).

ابزارهایی برای "خواندن" گزارش های فلورسنت

در فهرست ابزارهای دریافت و تحلیل «پیام‌های» خبرنگاران فلورسنت، از نظر تاریخی اولین چشم ماست. با کمک آن می توان مشاهدات بصری درخشش فلورسنت را بر روی اشیاء ماکروسکوپی به طور مستقیم و در موارد میکروسکوپی - با استفاده از یک میکروسکوپ فلورسنت (شومرانسان) انجام داد. نمونه‌هایی از اجسام ماکروسکوپی کلنی‌های میکروبی هستند که FBs، کروماتوگرام‌ها و الکتروفورگرام‌ها را با استفاده از رنگ‌های فلورسنت بیان می‌کنند. و میکروسکوپ فلورسانس "معمولی" (در مورد میکروسکوپ های "غیر معمول" کمی دورتر) اغلب برای تشخیص واکنش های ایمنی با استفاده از آنتی بادی های برچسب گذاری شده با فلوروفورها و همچنین در برخی از مطالعات در سطح تک سلولی مورد بررسی قرار می گیرد. با این حال، امکانات تجزیه و تحلیل بصری به طور قابل توجهی محدود است کیفیتارزیابی "سیگنال" خبرنگاران فلورسنت: "درخشش وجود دارد - بدون درخشش" در منطقه خاصی از نمونه. اگر «گزارش‌های فلورسنت» را بخوانید و رمزگشایی کنید، می‌توانید اطلاعات بیشتری به دست آورید. کمیویژگی های درخشندگی (به بخش مراجعه کنید "زبان" خبرنگاران فلورسنت).

توصیف کمی فلورسانس نیاز به اندازه گیری با استفاده از ابزارهای خاص و یک روش خاص دارد. به طور معمول، دو روش برای اندازه گیری پارامترهای فلورسانس قابل تشخیص است. اولین مورد برای اندازه گیری ویژگی های مختلف فلورسانس در یک منطقه نسبتاً بزرگ (ماکروسکوپی) از جسم استفاده می شود که به دست آوردن یکپارچه ( متوسط) ویژگی های فلورسانس جسم: محلول، تعلیق ذرات کلوئیدی، سلول ها، ذرات زیر سلولی و غیره. روش دوم بر اندازه گیری در سطح تمرکز دارد اجسام تک میکروسکوپی- در درجه اول سلول ها و ذرات درون سلولی.

اندازه‌گیری‌های فلورسانس یکپارچه با استفاده از اسپکتروفلورسنج‌ها (طیف‌فتومترهای فلورسنت) و فلورسنج‌های صفحه‌ای انجام می‌شوند. انگلیسی. صفحه خوان). طیف‌سنج‌ها عموماً ابزارهای تحلیلی هستند که می‌توان از آنها برای به دست آوردن تمام ویژگی‌های اساسی فلورسانس استفاده کرد. فلورمترهای صفحه ای دستگاه هایی هستند که برای آنالیز جرمی تعداد زیادی نمونه طراحی شده اند (پلیت های استاندارد برای 96، 384 یا 1536 نمونه طراحی شده اند). اندازه گیری در آنها با توجه به چندین ویژگی ثابت انجام می شود - به عنوان مثال، با توجه به شدت فلورسانس در یک منطقه طیفی خاص. اخیراً فلورومترهای صفحه ای با توانایی اندازه گیری پارامترهای فروپاشی فلورسانس و در نتیجه تخمین طول عمر فلوروفورها در حالت برانگیخته ظاهر شده اند. اکثر تکنیک‌ها با استفاده از فلورمترهای صفحه‌ای بر اساس واکنش‌های ایمونولوژیک یا تجزیه و تحلیل رشد کشت‌های سلولی در تک لایه‌ها هستند.

روش اندازه گیری فلورسانس اجسام تک میکروسکوپی نیز دو گزینه دارد. اولین مورد مبتنی بر بدست آوردن تصاویر دیجیتالی از ریزابژه های فلورسنت است ( انگلیسی. تصویربرداری فلورسانس) به دنبال آنالیز کامپیوتری آنها ( انگلیسی. تجزیه و تحلیل تصویر کامپیوتری). مورد دوم مبتنی بر اندازه گیری "یک به یک" فلورسانس اجسام ریز در جریان هنگام عبور از مویرگ باریک یک دستگاه خاص - فلوسیتومتر ( انگلیسی. فلوسیتومتر).

تصاویر دیجیتالی از ریز اشیاء فلورسنت با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس به دست می آیند که اخیراً یک انقلاب فنی واقعی را تجربه کرده است. بنابراین، به طور خاص، همراه با میکروسکوپ های فلورسنت استاندارد، دوربین های دیجیتال و کامپیوترها به طور قابل توجهی بهبود یافته است، دستگاه های اساسی جدید توسعه یافته اند. اول از همه، اینها به اصطلاح میکروسکوپ های کانفوکال هستند (شکل 8). در یک میکروسکوپ کانفوکال، فلورسانس برانگیخته می شود و از طریق یک سوراخ میکروسکوپی ثبت می شود که درخشش "اضافی" را که خارج از کانون شی رخ می دهد، قطع می کند. با اسکن این "مردمک نوری" در صفحه افقی و/یا عمودی، ثبت سیگنال ها با مولتی پلایر نوری و پردازش توسط کامپیوتر، تصویری فضایی از جسم فلورسنت به دست می آید. این طراحی در درجه اول اجازه می دهد تا تصاویر دو بعدی و سه بعدی واضح تری نسبت به میکروسکوپ های استاندارد داشته باشید. علاوه بر این، پارامترهای فروپاشی فلورسانس را می توان با استفاده از میکروسکوپ های کانفوکال مدرن اندازه گیری کرد.

شکل 7میکروسکوپ کانفوکال

با این حال، نوع دیگری از میکروسکوپ "انقلابی" بر خلاف اصول اولیه فیزیکی فلورسانس عمل می کند. تحریک اتم ها در آنها توسط نور با طول موج انجام می شود بیشترطول موج فلورسانس... (به بخش مراجعه کنید فلورسانس: لومینسانس ناشی از نور). در واقع قوانین اساسی فیزیک در حین کار این میکروسکوپ ها نقض نمی شود. به سادگی، با شدت کافی از شار نور با طول موج بیشتر از طول موج فلورسانس ممکن، دو فوتون می توانند همزمان به یک اتم وارد شوند، انرژی جذب شده توسط الکترون ها دو برابر می شود، و معلوم می شود که برای تحریک فلورسانس کافی است. بنابراین، چنین میکروسکوپ هایی نامیده می شوند دو فوتون. "اصابت" همزمان دو فوتون به یک اتم یک پدیده نسبتاً غیرمحتمل است و فقط در جایی رخ می دهد که شار نور حداکثر متمرکز باشد، یعنی. در فوکوس لنز این تصاویر فلورسنت با وضوح بالا را ارائه می دهد. مزایایی که میکروسکوپ های دو فوتونی را از سایر میکروسکوپ ها متمایز می کند همچنین شامل توانایی آنها در تشخیص فلورسانس در نمونه ها در عمق تا عمق 1.5 میلی متری (گزارش هایی از نفوذ به عمق بیشتر وجود دارد) و همچنین توانایی آنها برای کاهش قابل توجه عوارض جانبی است. اثر تابش برانگیختگی هم بر روی اجسام مورد مطالعه و هم بر گزارشگران فلورسنت.

تکنیک‌های تحلیلی ویژه (به اصطلاح طیف‌سنجی همبستگی فلورسانس) استفاده از میکروسکوپ کانفوکال و دو فوتونی را برای مطالعه حرکت مولکول‌های فلورسنت منفرد (!) ممکن می‌سازد.

با این حال، "در بالای" میکروسکوپ نوری مدرن از نظر وضوح، به اصطلاح "نانوسکوپ"، یعنی میکروسکوپ هایی قرار دارند که تشخیص اجسام فلورسنت را در تصویر، که فاصله بین آنها چندین نانومتر است، ممکن می سازد. دو نوع از این دستگاه ها وجود دارد. اولین مورد بر اساس اسکن نمونه با دو پرتو باریک تابش لیزر است. خواص نوری آنها طوری انتخاب می شود که یکی از آنها فلورسانس را در ناحیه "ضروری" تحریک می کند و دیگری آن را در ناحیه "غیر ضروری" مجاور سرکوب می کند. اندازه ناحیه "مورد" می تواند در حد چند نانومتر باشد. این روش میکروسکوپ STED نامیده می شود.

اصل عملکرد نانوسکوپ های نوع دوم بر اساس امکان "روشن و خاموش کردن" نوری فلورسانس فلوروفورهای منفرد است. تصویر یک نمونه را چندین بار از جمله یک یا مولکول دیگر دریافت کنید. سپس کامپیوتر تصاویر را روی هم قرار می‌دهد و در تصویر ترکیبی، می‌توانید درخشش هر یک از مولکول‌های مجاور را ببینید. در یک میکروسکوپ "معمولی"، حتی اگر هم کانونی باشد، آنها در یک نقطه نورانی ادغام می شوند. این روش میکروسکوپ PALM نامیده شده است.

"گزارش های فلورسنت" ثبت شده به عنوان تصاویر دیجیتال "رمزگشایی" می شوند، یعنی اطلاعات کمی با استفاده از برنامه های کامپیوتری ویژه تجزیه و تحلیل تصویر استخراج می شود. به این ترتیب، اندازه گیری شدت فلورسانس و توزیع فضایی آن، ارزیابی ویژگی های طیفی تابش (تحلیل شبه طیفی)، تعیین تعداد ذرات فلورسنت (به عنوان مثال، سلول ها) و مشخص کردن پارامترهای زمانی و قطبی شدن تابش امکان پذیر است. فلورسانس

همچنین باید به اطلاعات زیبایی شناختی میکروسکوپ فلورسانس توجه داشت. گزارشگران فلورسنت در فتومیکروگراف ها دنیای شگفت انگیزی از ترکیب های عجیب رنگ ها و اشکال را برای ما آشکار می کنند (شکل 8 را ببینید). سازندگان میکروسکوپ نیکون و Olympus حتی مسابقات عکس سالانه در مورد جهان خرد را در پرتو فلورسانس برگزار می کنند. گالری آثار برنده در این مسابقات را می توانید در وب سایت های Olympus BioScapes و Nikon Small World بیابید.

شکل 8. میکروگراف های فلورسانس از گالری مسابقه سالانه نیکون Small World. 1. فیبروبلاست موش. 2. Copepod Temora longicornis. 3. میتوز در سلول های ریه نیوت. 4. سلول های گلیال مخچه موش in vivo(میکروسکوپ فلورسانس دو فوتونی).

بر خلاف میکروسکوپ های فلورسانس، فلوسیتومترها اجازه مشاهده اجسام فلورسنت را نمی دهند. به عنوان یک قاعده، اینها سوسپانسیون های سلولی حاوی فلوروفورها هستند. قدرت فلوسیتومترها سرعت ثبت سیگنال از اجسام منفرد است. یک سیتومتر معمولی در دسترس تجاری به شما امکان می دهد سیگنال های فلورسنت از سلول ها را با سرعت 1000 سلول در ثانیه اندازه گیری کنید، و آنهایی که کارایی بالایی دارند - تا 25000 سلول در ثانیه! نسخه استاندارد کار شامل اندازه گیری هر جسم از دو تا ده پارامتر است: پراکندگی نور و فلورسانس یک یا چند فلوروفور. اندازه گیری روی آرایه بزرگی از اشیاء به دست آوردن نتایج آماری قابل اعتماد در مطالعه ناهمگونی جمعیت های سلولی، به ویژه، میکروبی را ممکن می سازد.

همراه با فلوسیتومترهای معمولی، دستگاه‌هایی وجود دارند که قادرند سلول‌ها را بر اساس پارامترهای خاصی از پراکندگی نور یا فلورسانس جدا (مرتب‌سازی) فیزیکی کنند. این امر امکان مطالعه بیشتر زیرجمعیت های خاص را با استفاده از روش های دیگر باز می کند.

آنچه خبرنگاران فلورسنت "گزارش می کنند"

همانطور که قبلا ذکر شد (به بخش مراجعه کنید خبرنگاران فلورسنت، همه گزارشگران فلورسنت دارای "تخصص" هستند، یعنی. می توانند به طور انتخابی ویژگی های خاصی از یک سیستم بیولوژیکی را مشخص کنند. اجازه دهید به اختصار به چند دسته از «متخصصان» بپردازیم.

با طیف وسیعی از گزارشگرهای فلورسنت، امکان نظارت وجود دارد کاتالیز آنزیمی. به عنوان یک قاعده، اینها فلوروفورهای آلی هستند. بنابراین، برای مثال، بسترهایی با فلوروفورهای متصل به کووالانسی ایجاد کنید، که تنها پس از آزاد شدن در طی واکنش شروع به فلورسانس می کنند. این به عنوان یک "پیام" در مورد سیر کاتالیز آنزیمی عمل می کند. روش دیگر استفاده از "پروفلووروفور" است که در نتیجه برهمکنش با محصول واکنش، فلورسنت می شود. گزارشگرهای فلورسنت واکنش های آنزیمی برای مطالعه پویایی فرآیندها و همچنین محلی سازی آنها در سلول ها، بافت ها، اندام ها و غیره استفاده می شود.

گزارشگران تشکیل شده بر اساس آنتی بادی "اطلاعات" در مورد دوره واکنش های ایمونولوژیک. آنها کمپلکس های فیزیکی یا ترکیبات کووالانسی فلوروفورها با آنتی بادی ها (ایمونوگلوبولین ها) هستند. امکان استفاده از تمام فلوروفورهای آلی و معدنی شناخته شده، از جمله نقاط کوانتومی، به عنوان یک جزء فلورسنت نشان داده شده است. علاوه بر این، آنزیم ها را می توان به آنتی بادی ها متصل کرد تا واکنش ها را با تشکیل یک محصول فلورسنت کاتالیز کند. با کمک گزارشگران فلورسنت ایمونولوژیک، وجود پروتئین های آنتی ژن خاصی در نمونه ها و همچنین محلی سازی آنها تشخیص داده می شود. به عنوان مثال، میکروفیبریل ها در فیبروبلاست های موش نشان داده شده در شکل 8 (عکس 1) با استفاده از آنتی بادی های فلورسنت شناسایی شدند.

بسیاری از انواع اطلاعات را می توان با استفاده از FB به دست آورد. روش‌هایی برای ایجاد ژن‌های پروتئینی ترکیبی حاوی FB به عنوان برچسب فلورسنت برخی از پروتئین‌های طبیعی یا حتی اسید نوکلئیک ایجاد شده‌اند. معرفی ژن های چنین "هیبریدها" به سلول ها تعیین "آدرس" توسط فلورسانس را امکان پذیر می کند. محلی سازی اجزای مولکولی سلول های زنده، دینامیک سنتز و حرکات آنها را دنبال کنید. یک وابستگی به pH فلورسانس پروتئین های هیبریدی حاوی PB وجود دارد که برای اندازه گیری pH داخل سلولی. مزیت چنین گزارشگرهای pH نسبت به سایر فلوروفورهای آلی حساس به pH، امکان اندازه گیری pH در داخل محفظه های مختلف درون سلولی (ارگانل ها) است، جایی که جزء اصلی هیبرید "خطاب" است.

استفاده از FB های مختلف در ترکیب با تکنیک های اندازه گیری فلورسانس مبتنی بر WET بسیار مورد توجه است. برای مطالعه تعامل یا هم محلی سازیدر سلول های هر دو پروتئین، دو FB به آنها متصل می شود، طوری انتخاب می شوند که وقتی به یکدیگر نزدیک می شوند، تأثیر BET امکان پذیر باشد. به همین ترتیب، می توان مطالعه کرد تغییرات ساختاری (ساختاری).در پروتئین ها برای این منظور FB های مربوطه به قسمت های مختلف مولکول پروتئین متصل می شوند. ظاهر اثر BET نشان‌دهنده همگرایی FBs و بنابراین، بازآرایی‌های ساختاری در پروتئین مورد مطالعه است. "ساخت" سه پروتئین بر اساس یک اصل کار می کند که به عنوان یک شاخص استفاده می شود محتوای یون های Ca2+ در سلول های زنده. این شامل دو FB و پروتئین کالمودولین متصل کننده Ca 2+ بین آنهاست. هنگامی که Ca 2+ متصل می شود، ترکیب کالمودولین تغییر می کند، FB ها به یکدیگر نزدیک می شوند و سیگنال PET می دهند. در اینجا مناسب است اشاره کنیم که گزارشگرهای فلورسنت آلی "ساده" در داخل سلول ها وجود دارند تا یون های Ca2+ را شناسایی کنند. از سوی دیگر، گزارشگران پروتئین را می توان با دقت بیشتری به اجزای درون سلولی خاص، یا با تزریق میکرو یا با ادغام در ساختار پروتئین با محلی سازی درون سلولی خاص، «خطاب» کرد.

حساسیت فلورسانس به خواص فیزیکی ریز محیطی که مولکول های فلوروفور در آن قرار دارند، امکان استفاده از برخی از آنها را به عنوان گزارشگر پارامترهای مختلف محیط درون سلولی فراهم می کند. اندازه گیری درون سلولی ویسکوزیتهبر اساس وابستگی قطبش فلورسانس به انتشار چرخشی گزارشگران. با تشکر از خبرنگاران ویژه انتخاب شده، امکان اندازه گیری ویسکوزیته سیتوپلاسم در داخل برخی از اندامک ها و همچنین در لایه آبگریز بیوممبران وجود داشت. برهمکنش برخی فلوروفورها با غشاهای بیولوژیکی به تفاوت پتانسیل الکتریکی در آنها بستگی دارد. با کمک چنین خبرنگارانی اطلاعاتی در مورد ارزش دریافت می کنید پتانسیل غشایی. برای اندازه گیری دمای داخل سلولیانواع مختلفی از گزارشگرهای فلورسنت بر اساس لانتانیدها، نقاط کوانتومی، پلیمرهای حساس به حرارت و فلوروفورهای آلی ایجاد شده‌اند. چشمگیرترین نتایج از فلوروفورهای آلی طراحی شده ویژه به دست آمده است، که قادر به "گزارش" دما در قسمت های مختلف سلول ها، "رمزگذاری" شده در پارامترهای دینامیکی فروپاشی فلورسانس هستند.

به لطف خبرنگاران فلورسنت چه چیزهای جدیدی در مورد دنیای خرد آموخته ایم؟

خبرنگاران فلورسنت برای مدت طولانی با موفقیت در خدمت زیست شناسی و پزشکی تجربی بوده اند. فقط فهرستی از گزینه های مختلف برای کاربرد آنها می تواند حجم بیش از یک مقاله باشد. با این حال، مناطقی وجود دارد که آنها نقش کلیدی در مطالعه خواص و پدیده های اساسی سیستم های بیولوژیکی داشته اند. برای نشان دادن به برخی از آنها نگاهی می اندازیم.

با استفاده از گزارشگرهای فلورسنت به صورت تجربی ثابت شده است مدل ساختار کریستالی مایع همه غشاهای بیولوژیکی *. طبق این مدل، غشای بیولوژیکی با یکپارچگی ساختاری و ایجاد مانع نفوذپذیری برای مواد آبدوست، به اندازه کافی "مایع" است به طوری که اجزای جداگانه آن می توانند "آنطور که در نظر گرفته شده" در آن حرکت کنند. چنین ایده ای از غشاهای بیولوژیکی درک مکانیسم های مولکولی اساسی عملکرد آنها و همچنین به طور کلی خواص سلول های زنده را ممکن می سازد.

* - به لطف تکنیک های فلورسنت، مشخص شد که غشاء فقط یک "دریای" غیرفعال از فسفولیپیدها نیست که "جزایر" پروتئین های غشایی در آن شناور هستند، بلکه یک شرکت کننده کامل در بسیاری از فرآیندهای مهم بیوفیزیکی است: « » . - اد.

مکانیسم های تبدیل انرژیدر سلول ها نیز عمدتاً به دلیل اطلاعات گزارشگران فلورسنت روشن شده است. فلوروفورها در اینجا نقش ویژه ای ایفا کردند و ثبت pH داخل سلولی و داخل میتوکندری و همچنین تفاوت پتانسیل های الکتریکی در سراسر غشاها را ممکن ساختند. با کمک آنها، اول از همه، مکانیسم ترکیب واکنش های اکسیداسیون اهداکننده انرژی با سنتز مصرف کننده انرژی آدنوزین تری فسفات (ATP)، یک اهداکننده انرژی جهانی برای اکثر فرآیندهای متابولیک، آشکار شد. علاوه بر این، ماهیت تجمع مواد مختلف در سیتوپلاسم و اندامک‌های سلولی به دلیل پتانسیل الکتریکی غشاء و گرادیان pH مورد مطالعه قرار گرفت.

* - در مورد دستگاه سنسور pH فلورسنت به مقاله مراجعه کنید « » . - اد.

فعالیت حیاتی سلول ها با ترکیبی فراهم می شود هماهنگ در فضا و زمانواکنش های بیوشیمیایی این هماهنگی به دلیل تعامل خاص اجزای به اصطلاح انجام می شود علامتسیستم های. اجزای اصلی این سیستم ها با استفاده از تکنیک های بیوشیمی مرسوم و زیست شناسی مولکولی جدا و مشخص شده اند. با این حال، تنها با ظهور رویکردهای مبتنی بر استفاده از گزارشگرهای فلورسنت، امکان کسب اطلاعات در مورد سازماندهی فضایی و زمانی مسیرهای سیگنالینگبه طور مستقیم در سلول ها بنابراین، به طور خاص، امکان نظارت در زمان واقعی پویایی فضایی تعامل اجزای پروتئینی سیستم های سیگنالینگ وجود دارد. این امکان مطالعه انتشار، تقویت و ادغام سیگنال ها در سلول ها را فراهم می کند. علاوه بر این، ارزیابی پویایی بیان ژن در سطح سلول های منفرد امکان پذیر شده است، که امکان نزدیک شدن به توسعه مفاهیم فردیت سلول را برخلاف رویکردهای آماری سنتی فراهم می کند. همچنین لازم به ذکر است که با کمک گزارشگران فلورسنت، امکان شناسایی اجزای سیگنال قبلا ناشناخته وجود داشت. به عنوان مثال، نقش اساسی یون های Ca2+ به عنوان یک واسطه سیگنال در بسیاری از واکنش های تنظیمی آشکار شد.

در نیمه دوم قرن گذشته، مشکلی در میکروبیولوژی به وجود آمد که به آن "ناهنجاری بزرگ شمارش میکروارگانیسم ها با استفاده از ظروف پتری" لقب گرفت. معلوم شد که "مقصران" خبرنگاران فلورسنت، دو رنگ اسید نوکلئیک - آکریدین نارنجی و 4،6-دیامیدینو-2-فنیلندول بودند. در مطالعات متعددی بر روی نمونه‌های طبیعی، به‌طور مداوم بین داده‌های مربوط به محتوای میکروارگانیسم‌ها، به‌دست‌آمده از شمارش کلنی‌های سلول‌های تکثیر شده روی ظروف پتری، و داده‌های شمارش مستقیم میکروارگانیسم‌های رنگ‌آمیزی شده با رنگ‌های اسید نوکلئیک فلورسنت با استفاده از میکروسکوپ، اختلاف وجود دارد. . گزارشگران فلورسنت همیشه ارگانیسم های بیشتری را نسبت به روش پتری دیش شناسایی کرده اند. دو فرضیه برای توضیح این داده ها مطرح شد. طبق اولی، برخی از سلول ها ممکن است در حالت "استراحت" خاصی باشند و روی ظروف پتری تکثیر نشوند. طبق دوم، شرایط کشت (ترکیب محیط، دما و غیره) با "نیازهای" بخش خاصی از جمعیت برای تولید مثل مطابقت ندارد. آزمون این فرضیه ها نشان داد که هر دوی این احتمالات قابل تحقق است. علاوه بر این، انگیزه ای برای شکل گیری دو خط اصلی جدید تحقیقاتی داده شد.

اولین مورد مربوط به مطالعه به اصطلاح "وضعیت زنده اما کشت نشده میکروارگانیسم ها" است. اهمیت ویژه این جهت به دلیل وجود چنین شرایطی در بسیاری از میکروارگانیسم های بیماری زا برای انسان است. در این حالت، آنها، همانطور که بود، برای روش های تشخیصی استاندارد "نامرئی" هستند. علاوه بر این، در این حالت مقاومت آنها در برابر داروها افزایش یافته است.

جهت دوم شناسایی و مطالعه میکروارگانیسم ها به طور مستقیم در نمونه های طبیعی (لات. در موقعیت، به معنای واقعی کلمه - در محل) با آنالیز مستقیم اسیدهای نوکلئیک آنها بدون اینکه ابتدا کشت خالص بدست آید، همانطور که قبلا انجام شد. این جهت حتی نام خود را دارد - متاژنومیکس. به لطف روش های متاژنومیکس، که به هر حال، برخی از آنها مبتنی بر استفاده از گزارشگران فلورسنت هستند، امکان ارزیابی مجدد تنوع بیولوژیکی میکروارگانیسم ها در اکوسیستم های فردی و روی زمین به طور کلی فراهم شد. این گونه است که گزارش‌های «ساده» دو خبرنگار فلورسنت به ظهور دو حوزه تحقیقاتی مهم در میکروبیولوژی مدرن کمک کردند.

بنابراین، خبرنگاران فلورسنت امروز نماینده ارتش بزرگی از "متخصصان" متنوع هستند که سابقه درخشانی در زیست شناسی تجربی و پزشکی دارند. گزارش‌های فلورسنت آن‌ها امکان «دیدن» آن گوشه‌های کیهان کوچک را که نور می‌تواند در آن‌ها نفوذ کند را ممکن می‌سازد. علاوه بر این، برای دیدن نه تنها بصری، بلکه از نقطه نظر درک الگوهای فیزیکوشیمیایی و بیولوژیکی. با این حال محققانی که بر روی توسعه و کاربرد این «دستیارهای مولکولی» در مطالعه دنیای خرد کار می کنند، معتقدند که این تنها آغاز راه است!

ضبط ویدیویی پنجمین سمینار شورای دانشمندان جوان مؤسسه شیمی بیورگانیک آکادمی علوم روسیه: "فناوری تمرکز ذرات آکوستیک در فلوسیتومتری"؛

پایه لیپیدی زندگی؛

PH متر نانو؛

فراتر از سد پراش: جایزه نوبل شیمی 2014;

پوچکوف E.O. (2014). گزارشگران فلورسنت و گزارش آنها. شیمی و زندگی № 9 (2014) , 8–13. .

طبقه بندی انتقال های الکترونیکی

نمودار یابلونسکی

فرآیندهای فیزیکی که در حالت برانگیختگی الکترونیکی مولکول‌ها اتفاق می‌افتند معمولاً در قالب نمودار یابلونسکی نشان داده می‌شوند. فرآیندهای غیر تابشی اصلی غیرفعال کردن حالت برانگیخته پایین S1تبدیل داخلی (انتقال بین حالت‌های چندگانه یکسان) و تبدیل ترکیبی (انتقال بین حالت‌های چندگانه مختلف، به عنوان مثال، انتقال تک به سه‌گانه S 1 ®T 1). تبدیل داخلی S1® S0یک فرآیند نسبتا کند است. بنابراین، در حالت هیجان زده S1فرآیندهای انتشار خود به خود فوتون (گسیل خود به خود) و واکنش های فتوشیمیایی را می توان مشاهده کرد. فرآیندهای تشعشعی فلورسانس مجاز اسپین و فسفرسانس ممنوعه اسپین هستند.

طیف های جذب الکترونیکی در محدوده UV و مرئی اطلاعات مهمی در مورد ساختار و خواص حالت های برانگیخته الکترونیکی مولکول ها ارائه می دهند. آگاهی از طیف جذب یک ماده، پیش نیاز مطالعات فوتولومینسانس و فتوشیمیایی است. اجازه دهید به طور خلاصه به طبقه بندی انتقال های الکترونیکی بپردازیم

الکترون ها در یک مولکول آلی بر روی s-, p- و مولکولی قرار دارند n-اوربیتال ها هر اوربیتال مولکولی دو الکترون را با اسپین های متفاوت نگه می دارد. هنگامی که یک مولکول توسط نور برانگیخته می شود، یک الکترون از یک اوربیتال پیوند اشغال شده به یک اوربیتال ضد پیوند اشغال نشده حرکت می کند. چنین انتقال هایی با توجه به ماهیت مداری آنها تعیین می شوند: s-s*، n-s*، p-p* و n-پ*.

باندهای جذبی به دلیل انتقال s®s*، عمدتاً در ناحیه UV خلاء هستند< 200 нм, где обычные спектрофотометры не применимы.

انتقال ها n-s*مربوط به باندهای جذب در ناحیه UV است. به عنوان مثال، ترکیبات آلی حاوی n-الکترون‌هایی که در اوربیتال‌های هترواتم‌ها، O، N، S قرار دارند، نور UV را در ناحیه حدود 200 نانومتر جذب می‌کنند.

انتقال p®p*و n®p*مربوط به نوارهای جذبی در ناحیه میانی UV است. هنگامی که پیوندهای متعدد مزدوج می شوند، باندهای ناشی از این انتقال ها به نواحی نزدیک به UV و مناطق مرئی طیف منتقل می شوند. انتقال ها n®p* برای ترکیبات حاوی گروه های کروموفور مانند C=O، C=S، N=N معمولی است. این انتقال اغلب ممنوع است و نوارهای جذب مربوط به آنها شدت نسبتاً کمی دارند.

این طبقه بندی عمدتاً برای مولکول های نسبتاً ساده مناسب است. در مولکول های پیچیده، سهم خاصی در انتقال الکترونیکی می تواند توسط الکترون های واقع در اوربیتال های انواع مختلف انجام شود.

قابل توجه هستند انتقال الکترونیکی با انتقال شارژاگر مولکول حاوی گروه های الکترون دهنده و گیرنده باشد و آنها در مزدوج الکترون p باشند، انتقال S 0 ®S 1 می تواند با انتقال بار از دهنده به گیرنده در امتداد زنجیره همجوشی همراه باشد، به عنوان مثال، در این رنگ استایریل:

در این مورد، یکی از انتقال الکترونیکی از انتقال شارژ داخلی. نوارهای جذب مربوطه معمولاً با شدت بالا مشخص می شوند و در ناحیه مرئی و گاهی اوقات در ناحیه IR نزدیک قرار دارند.

برای کمپلکس‌های گیرنده ارگانیک با پیوند ضعیف، نوارهای جذب را می‌توان مربوط به یک انتقال الکترونیکی با انتقال بار از یک اهداکننده به یک گیرنده از طریق فضا مشاهده کرد. انتقال بار بین مولکولی). چنین مجتمع هایی اغلب به عنوان مجتمع های انتقال بار نامیده می شوند. باندهای جذب طول موج بلند چنین کمپلکس‌هایی شدت نسبتاً پایینی دارند و می‌توانند در نواحی طیفی نزدیک به UV، مرئی و نزدیک IR باشند.

در شیمی آلی فلزی، نوارهای جذب مربوط به انتقال بار از لیگاند به فلز متمایز می شوند. MFWP) و از فلز به لیگاند ( PMML).

مقالات مشابه